如何正确进行ELISA测定操作
I .临床标本的收集和保存
血清(血浆)是ELISA测定最常用的临床标本，有时唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本也用于特定的检测目的。目前临床上由血清样本确定的标志物一般包括感染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特殊蛋白、细胞因子、治疗药物等。对于用于激素和治疗药物测定的血清样本的采集，应注意采集时间甚至体位都可能对测定结果产生影响。比如可的松在凌晨4-6点之间会有一个峰值:生长激素、促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)都是以阵发性模式释放。因此，需要在紧密相连的时间间隔内取几份血样，取其中值作为测量值。再如，由卧位改为站立位时，血清中肾素的活性会明显升高。再比如治疗药物的检测，要根据药代动力学选择最佳的验血时间。用于检测传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特殊蛋白质的血清样本的采集对时间和姿势没有影响，但在处理和保存时应考虑以下方面:
(1)注意避免严重溶血。血红蛋白含有血红素基团，具有类似过氧化物的活性。因此，在以HRP为标志酶的ELISA测定中，如果血清样本中血红蛋白的浓度较高，在孵育过程中会很容易吸附在固相上，从而与后面加入的HRP底物发生反应而显色。
(2)在样本采集和血清分离过程中，应注意尽可能避免细菌污染，因为细菌的生长，其分泌的一些酶可能会分解抗原、抗体等蛋白质；其次，某些细菌的内源性酶，如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶，会对相应酶标记的测定方法造成非特异性干扰。
(3)血清标本如经无菌操作分离，可在2 ~ 8℃保存一周，如经细菌操作，建议冷冻保存。样品的长期保存应在-70℃以下。
(4)注意避免冰冻血清样本因断电而反复冻融。标本反复冻融产生的机械剪切力会破坏标本中的蛋白质等分子，从而造成假阴性结果。另外，还要注意冻融标本的混合，不要剧烈振荡，要反复混合。
(5)保存过程中如有细菌污染造成浑浊或絮状物，应离心沉淀后取上清液检测。
二、试剂准备
在临床实验室中，试剂的制备一般不受重视。通常的做法是将试剂从冰箱中取出，在实验过程中立即使用，忽略了这种做法可能会影响日后孵育时间不足的问题，直接后果就是一些弱阳性样本会出现假阴性。所以在ELISA的试剂准备中，最重要的是在实验开始前将试剂盒从冰箱中取出，在室温下放置20分钟以上，然后进行测量，这样试剂盒在使用前就可以与室温达到平衡。这样做的目的主要是使反应微孔中的温度在后续的孵育反应步骤中快速达到所需的高度，以满足测定要求。其次，目前市售的酶联免疫试剂盒中的洗板液在实验室使用时需要用提供的浓缩液稀释配制，所以稀释用的蒸馏水或去离子水的质量要有保证。此外，当OPD用作试剂盒中的底物时，应在反应显色前临时制备底物溶液。
第三，添加血清样本和反应试剂
在目前的商业ELISA试剂盒中，加入血清样品几乎是使用微量取样器加入样品的唯一步骤。使用微量取样器时必须注意的要点是:加样不要太快，要避免加到孔壁上部，不要溅出和产生气泡。太快了，无法保证微量添加的准确性和均匀性。加到孔壁上部未涂覆区域容易引起非特异性吸附。飞溅会污染相邻的孔。出现气泡时，反应液界面不同。在国产试剂盒中，试剂基本都是从滴瓶中滴出。除了下落的角度，下落的速度也很重要。如果滴加过快，容易在两个孔之间重复滴加或添加，会导致孔的未涂区域发生非特异性吸附，从而引起非特异性显色。所以有时候同一个试剂盒的一个样本，这次是阳性，下次是阴性，往往是由于上述添加样本和试剂的错误造成的。
第四，温暖教育
孵育是影响ELISA成败的最关键因素。ELISA是一种固相免疫分析方法，抗原和抗体的结合反应是在固相上进行的。为了使液相中的抗原或抗体与固相上的特异性抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度下反应一定的时间。孵化所需时间与温度成反比，即温度越高，所需时间越短。最常用的孵育温度是37℃和室温，其次是43℃和2 ~ 8℃。
孵育是临床ELISA中最容易出现问题的。通常国产商用ELISA试剂盒的反应孵育时间为37℃30分钟~ 1小时，而进口ELISA试剂盒的反应孵育时间通常为37℃1 ~ 2小时，可能会影响测定下限。因此，关于孵化，在实际测量操作中必须注意以下几点:
(1)确保在设定温度下有足够的反应时间。一般来说，加入样品和/或试剂后，将微孔板从室温下拿到水浴箱或培养箱中时，孔内温度从室温上升到37℃需要一定的时间，尤其是室温比较低且不处于水浴状态时。然而，在临床实验室中，很少有人关注这个问题。通常微孔板一放入培养箱就计时，这样容易导致实际测量的孵育时间。南方某血库的同事曾经提出过一个问题，就是每年的冬天，总有一个多月。在HBsAg测定的室内质控中，对卫生部临床检验中心提供的1 ng/ml弱阳性样本进行测定时，总是检测不到。我不知道为什么。这可能与我国南方冬季室内温度低有关。此时微孔板转移到培养箱后37℃孵育时间不够，使弱阳性样本为阴性。因此，为了保证在37℃下有足够的孵育时间，检验科可以自行确定微孔板在本实验室不同季节(不同室温下)从室温拿到培养箱后，孔内温度达到37℃需要多长时间，从而适当延长板条在培养箱中的放置时间。具体是在板孔反应液中放置一个小温度计进行测量和观察。
(2)培养温度的选择。在一些ELISA试剂盒的说明书中，指出有两个孵育温度，比如一个是37℃1小时，一个是43℃45分钟。从免疫分析中抗原抗体反应的性质来看，在较低温度下长时间反应最完全。例如2-8℃下24小时。在较高的反应温度下，由于分子运动的遗憾，反应时间缩短，对于分子含量较多的强阳性样品的测定没有问题，但对于分子含量较少的弱阳性样品，有可能漏检。因此，我们建议在临床ELISA测定中应尽可能使用较低孵育温度和较长反应时间的条件。
(3)消除“边缘效应”。过去在使用96孔板的ELISA测定中，经常发现有“边缘效应”，即外围孔的颜色比中心孔的颜色深。这种“边缘效应”的原因可能是96孔板的外围孔和中心孔之间的表面或热力学特性的差异。但也有研究证实，孵化中的热力学梯度可能是根本原因。聚苯乙烯本身是不良的热导体。在实验室常规的ELISA测定中，当平板从室温(通常在25℃左右)放入37℃的培养箱中，同时平板也被加热时，周边孔和中心孔之间可能存在热力学梯度。因此，在使用水浴或向板孔中加入反应液时，将板和溶液加热到孵育温度(如37℃)，很容易消除“边缘效应”，提高测定的重复性。
综上所述，在临床ELISA测定中，为了保证良好的测定效果，可以采用以下几种简单的方法来保证孵育条件，即尽量使用水浴，孵育时使微孔板浮在水面上，或者将浸过水的砂布放入大饭盒中的湿盒中，放入暖盒中， 由于板条孔底部直接与水或湿布接触，在37℃和水浴箱或湿箱的高温下，反应溶液的温度可以随温室快速变化。
五，洗板子
固相免疫分析是一种非均相免疫分析技术，需要通过洗涤操作将特异性结合于固相的抗原或抗体与反应孵育过程中吸附的非特异性成分分离，以保证ELISA的特异性。因此，洗板也是ELISA测定中极其关键的一步。以HRP为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗涤液一般是含有0.05%Tween20的中性PBS，Tween20是一种同时含有亲水基团和疏水基团的非离子去污剂。其在洗涤中的作用机理是其疏水基团通过疏水相互作用与被动吸附在聚苯乙烯固相上的蛋白质的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白质和固相的吸附。同时，在液相中亲水基团和水分子的共同作用下，蛋白质可以从固相中分离出来，进入液相，从而达到去除非特异性吸附剂的目的。但是，由于抗体或抗原的包被通常是在碱性条件下通过与固相的疏水相互作用被动吸附在固相上的，所以要注意非离子去污剂的浓度。洗板液中Tween20浓度高于0.2%，会脱附包被在固相上的抗原或抗体，影响检测下限。
在临床实验室中，ELISA洗板一般有两种方式，即手动和洗板机。手动洗板是指每次反应孵育后，将反应液吸出或甩干，然后将板孔灌满洗涤液，静置2 ~ 3分钟后，将洗涤液吸出或甩干，然后在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3 ~ 4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。用洗衣机洗板就是把上面的人工操作改成用洗衣机洗板。用洗衣机洗盘子的一个特点就是每次洗完都拍不干，所以液体残留比较多。液体残留少的洗衣机比残留多的洗衣机需要更少的次数来彻底清洗板材。具体检验科用多少次洗衣机才符合要求？可进行以下简单实验:选择4×8 HBsAgELISA包被板条，每隔2×8孔加入相同的弱阳性和阴性样品，按试剂盒说明加入酶结合物，完成孵育。洗板孔时，第一排洗1次，第二批洗两次，第三排洗三次——直到第八排洗八次，加底物显色测定。如果洗涤三次，则显色不会改变，即洗涤三次的板孔的比色测定与洗涤四次和五次的板孔的吸光度相同，正/负值保持最大值。
第六，色彩开发
在目前市售的以HRP为标志酶的ELISA试剂盒中，如果以TMB为底物，提供的底物是两瓶应用液A和B；如果使用OPD作为基质，试剂盒提供使用前制备的OPD片剂或粉末。一般市售试剂盒的显色反应条件为37℃或室温15 ~ 30分钟。理论上，HRP的底物催化反应可在37℃下30分钟内完成，尽管大部分催化反应可在最初的10分钟内完成。因此，为使弱阳性样品的孔充分显色，建议在37℃下25 ~ 30分钟后终止反应比色测定。
另外，在加入底物开始显色反应前，最好检查底物溶液的有效性，即在干净的空板孔或eppendorf管中加入一滴溶液A和溶液B，观察是否有显色，如果有，说明底物已经变质。以OPD为底物，配制后应无色，否则不能使用。以TMB为底物，整个显色反应过程不需要避光，而以OPD为底物，则需要避光。关于TMB和OPD的显色反应特点和注意事项，请参见前面章节。显色反应完成后，加酸终止反应，摇匀混匀后，即可进行以下比色测定或目测判断。
七、比色
ELISA的比色测定是用酶标仪进行的。有的同事可能会觉得，既然是用酶标仪进行的，这个时候什么都可以做。其实不是，因为更先进的酶标仪器有很多功能，如果使用不当，会得到无法理解的结果。比如用酶标仪比色测定后，很多阴性测定孔的吸光度值为阴性或者测定的假阳性率大大增加。这主要是由于没有正确理解和使用酶标仪造成的。至于如何正确理解和使用酶标仪，请参考后面的相关章节。这里，只强调以下两点:
在测量(1)比色法时，一定要注意酶标仪的波长是否调好了，或者使用的滤光片是否正确。在一些临床实验室中，酶联免疫测定同时使用TMB试剂盒和OPD试剂盒，而前者的比色波长为450nm，后者为492nm，因此需要根据需要随时更换过滤器。因此，容易出现光学滤波器误用的问题。
(2)单波长或双波长比色选择问题。中档及以上的酶标仪器，基本上同时具备单波长和双波长比色功能。所谓单波长比色测定，通常是在对显色吸收最大的波长处进行，如450nm或492nm而双波长双色酶标仪是在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm处测量一次，敏感波上下测得的吸光度是样品测得的酶反应特定显色的吸光度与板孔上指纹、划痕、灰尘等污垢造成的吸光度之和；在非敏感波长下测定，是指将波长改变到一定值，使样品的酶反应的特定显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度就是污垢的吸光度值。最后，酶标仪给出的值是敏感波长处的吸光度值与非敏感波长处的吸光度值之差。因此，双波长比色测定具有消除非特异性吸收、指纹、划痕、灰尘等影响的优点。对滴板本身和样品在板孔上的特定颜色的吸光度进行测定，一般没有必要设置空白孔。如果在使用双波长比色法时仍设置空白孔，可能会造成上述测量孔吸光度为负值的现象。因为ELISA中单个空白孔的非特异性吸收存在一定程度的不确定性，也就是说每次或同时可能得到不同的吸光度值，所以ELISA比色测定最好采用双波长比色法。
八。结果的判断
根据表达测定结果的方式，临床ELISA测定可分为定性测定和定量测定。定性只是对标本是否含有待检测的抗原或抗体作出“是”或“否”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。可见定性测定通常用于确定传染性病原体的抗原或抗体，以判断特定病原体感染的存在。定量测定是对标本中待检测抗原数量的定量测定，用特定值表示。定量测定基本用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。目前国内临床上使用的ELISA试剂盒大多用于感染性病原体抗原或抗体的定性测定，少数用于αFP、hCG、细胞因子的定量测定。ELISA定性测定中“阳性”和“阳性”的确定是以试剂盒确定的阳性测定值(临界值)为基础的。定量测定的“值”是基于通过同时测定试剂盒中的标准物质而获得的剂量-反应曲线(也称为标准曲线)。ELISA定性和定量结果的数据处理将在后面的专门章节中讨论。这里我只想强调的是，ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”结果只能依据试剂盒本身测定的临界值来判断，不能使用卫生部临床检验中心提供的弱阳性定值质控血清。为什么要强调这一点？这主要是因为很多基层实验室用部中心供应的弱阳性定值质控血清(过去也叫“临界值血清”)的吸光度来判断结果，如果高于它就判定为阳性，否则为阴性，不考虑试剂盒的临界值。至今仍有一些实验室坚持这种错误的做法。试剂盒临界值的建立是基于一系列的科学实验和统计学研究(见后)，部中心提供的弱阳性定值质控血清主要用于临床实验室的室内质控。
接下来，我们将解释ELISA定性结果确定中常用的一些缩写。
(1)S/CO:其中S是样品或标本的缩写，表示由标本确定的吸光度值，CO是截止值的缩写。除竞争抑制法外，其他ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于等于1时，样本为阳性，小于1时，为阴性。
(2)S/N或P/N:其中S同(1)，N为阴性对照的简称，P为患者的简称。早期的很多试剂盒都是以S/N或P/N≥2.1为阳性标准，有些试剂盒至今还在使用这种方法。该方法与S/CO法无本质区别，只是前者以阴性对照(n)的2.1倍作为临界值。
九。结果报告和解释
临床ELISA结果的报告相对简单。定性测定可以是阴性也可以是阳性；定量测定报告具体数值。结果的解释要复杂得多，需要实验室技术人员对所测项目有全面的知识基础。比如对乙肝“两个半”结果的解读，不仅需要检查者知道不同结果模式的临床意义，还需要对乙肝病毒的分子生物学、分子变异及其对表型的影响有更深入的了解。目前，检验已经不再是简单的实验室测量，而成为了一门临床医学学科，即检验医学，这就要求从事医学检验的检验医生不仅要知道自己在做什么，还要知道自己为什么要做，否则必然会被时代淘汰。
综上所述，虽然ELISA测定的操作步骤很简单，但可能影响测定结果的因素很多，分布在测定操作的各个步骤，尤其是加样、孵育、洗板。为了帮助您分析和找到测定中出现问题的可能原因，下表总结了常见问题及其原因。
临床ELISA测定中可能出现的问题及原因
提问
可能的原因(不是套件本身的原因)
1.无法检测到弱阳性质控样本。
孵化时间或温度不够；显色反应时间太短；用来配制缓冲液的蒸馏水有问题。
2.测定的重复性差。
(同一样品的两次测定结果不一致)
这是由测定操作引起的典型问题，包括
(1)样本添加和测试剂量不正确；孔与孔之间不一致；
(2)加样过快，孔间出现污染；
(3)加错样本；
(4)添加样品和试剂时，添加到孔壁上部的未涂区域；
(5)将不同批号的试剂盒中的组分混合；
(6)孵育时间、洗板和显色时间不一致；
(7)孔内被污染的杂物；
(8)酶标仪的过滤器不正确；
(9)血清样本在完全凝固前加入，反应孔内出现纤维蛋白凝块或残留血细胞，容易出现假阳性反应。
3.白色书写板
(阳性对照不显色)
(1)缺失的酶缀合物；
(2)洗涤液的配制有问题，如量筒不干净，含有酶抑制剂(如叠氮化钠)。
(3)省略显色剂A或B；
(4)终止剂用作显色剂。
4.所有板孔都是彩色的。
(1)洗板不干净；
(2)显色溶液变质；
(3)添加底物的吸收被酶污染；
(4)洗涤液被酶污染。