酵母双杂交文库-宝鸡生物的构建与筛选
我们有13年的图书馆建设经验，完成了上千个图书馆建设。采用的技术和试剂盒都是市场上最优质的文库构建试剂，保证了构建的每一个文库的各项指标都是市场最高标准，我们的文库构建成功率在98%以上。关于我们的图书馆建设产品，我们承诺以下指标，这些指标在国内公司中是最高的。
上海宝鸡结合多年的图书馆建设经验，大力推广“全直营”图书馆建设技术。与其他施工方法(主要是takara的SAMRT法和invitrogen的gateway法)相比，我们的产品在技术和质量上都有很大的优势。
关于我们的图书馆建设产品，我们承诺以下指标，这些指标在国内公司中是最高的:
原库容量大于1 * 10 7 cfu；
平均插入片段大于1200 BP；；
克隆阳性率达95%以上。
？1.我们用同源重组的方法构建文库，不需要任何内切酶切割和连接过程，保证基因不会被内切酶切掉，保证基因的完整性，而Clonetech的是通过内切酶连接构建的。
？2.因为我们是通过重组的方式将cDNA重组到载体中，比克隆技术的SMART T4连接酶法效率高很多，所以我们承诺原文库的文库容量会在1 * 10 7以上。而且重组的假阳性率很低。我们这里的一些客户一次测试了30，000个克隆，没有空负载。我们承诺阳性率大于98%，这是酶切连接法远不能比的。
？3.Clonetech的SMART方法使用PCR合成第二条链。由于PCR的选择性抑制和竞争性扩增，基因冗余度很高，低丰度的基因不能被PCR扩增，所以会丢失，长片段的基因也会丢失，会有很多重复序列。特别是当初始RNA样本量很小时(例如在5ug RNA下，需要15个循环以上的PCR扩增，大大降低了文库的质量)，文库中包含的基因数量大大减少。我们的cDNA合成方法是用多种酶在16度恒温下直接合成第二链，完全忠于样本本身的基因情况，不会人为改变样本中的基因情况和基因大小。
4.我们用的是高质量的逆转录酶，公认的最好的逆转录酶。与clonetech的逆转录酶相比，具有更高的逆转录温度(55摄氏度倒置，clonetech的逆转录酶采用42度倒置，更高的温度可以打开RNA的二级结构，获得更长的cDNA)，逆转录效率和cDNA长度都要好得多。我们承诺文库的平均插入片段在1.3KBP以上，最小长度在1Kbp以上，而clonetech的SMART方法构建的文库一般只有几百BP。
图书馆建设流程:
1.RNA提取
2.mRNA提取
3.3.cDNA的酶促合成
4.cDNA接头
5.cDNA是按长度分开的。
6.6.cDNA和酵母双杂交文库载体(pGADT7或pDEST22)的全直接重组。
7.重组产物的电转化
8.文库检测和质粒提取
3.1全直接法和SMART法的比较和优势
3.2?全直接法和网关法的比较和优势
25个工作日内，如需转化酵母，则延长15个工作日。
备注:1:此酵母库可添加均质步骤。我们可以利用DSN的均质化方法构建高质量的均质化酵母杂交文库，大大降低后续酵母筛选的工作量和筛选效率。
客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库，客户可以向我们提供组织、细胞或总RNA:
细胞样本:细胞数量大于1 * 10 7。
动物样本:大于1克
植物样品:大于2g
总RNA:超过200微克
目前，我们已经成功完成了数千个无样本库的构建。主要客户为中国科学院、上海植物生理生态研究所、上海交通大学、浙江大学、浙江省农业科学院、山东省农业科学院等单位完成了酵母双杂交文库的构建。物种包括人类、小鼠、大鼠、水稻、拟南芥、牡丹、稻飞虱、苹果、油菜、小麦、贝壳、葡萄、真菌等。
我们是国内为数不多的可以同时提供库建设和库筛选的公司。对于酵母双杂交筛选服务，您只需提供诱饵基因序列。我们将做以下工作，筛选价格为人民币3万元。
1.诱饵载体的测序验证及双杂交筛选载体的构建。
2.诱饵基因的自激活检测，检测合格后继续下一次实验。
3.诱饵质粒转化酵母细胞，验证后再转化文库质粒。
4.酵母菌的筛选及3AT条件的优化
5.筛查结果的排序
6.筛选结果的旋转验证
7.提交筛选结果:包括筛选报告、筛选结果的测序结果和blast结果、筛选结果克隆的质粒。
9.1.如何选择合适的建库方式来建库？
我们是市场上唯一一家可以同时提供三种建库方式的公司，足以说明我们公司的技术实力。※.
※三种方法的比较如下:
？1) Clonetech的聪明法，基本上淘汰了。上面我们有详细的技术对比，它唯一的优点是RNA的初始量可以很少，一般只需要几ug。这种方法成本很低，一般不推荐。
？2) invitrogen的方法，质量比SMART的好很多，对试剂的质量要求很高，必须全部使用invitrogen的原装试剂。我们都是用invitrogen公司的试剂来构建文库，并做一些技术上的改进来提高文库的质量。这种方法需要较高的初始RNA，推荐的初始剂量为200ug以上。但是这种方法有一个严重的缺点，就是需要两次重组才能获得酵母文库，多一次重组就会多一次文库扩增过程，严重影响文库的质量。上面有详细的技术对比和介绍。
？其他用这种方法建库的公司，只能用商业套件建库，没有任何改进。而且由于购买渠道的原因，他们买不到试剂盒里的一些试剂，质量也会大打折扣。比如用DH10B转化感受态细胞，这种感受态细胞的转化效率比国产的高100倍以上。这种有能力的电池需要很多海关审批才能购买，其他公司因为没有相关资质，无法进口。
？3)全直接专利法，这是我们的独家专利方法，是对invitrogen方法的重要改进，保留了它的优点(无需PCR扩增，文库保真度高)，去掉了它需要两次重组的缺点，大大提高了文库的质量。与invitrogen方法相比，平均长度可增加200bp，文库容量可增加10倍以上。该方法需要与invitrogen方法相同量的RNA。
9.2.宝鸡生物提供的酵母双论文库有哪些产品内容？
※我们提供的文库产品包括文库质量(200ug以上)和大肠杆菌文库中的甘油菌。同时，我们可以选择提供转化成酵母细胞的甘油细菌文库。我们会提供转化为酵母细胞的100文库甘油菌，我们可以做100文库筛选。
其中文库的质粒可以用* * *转化法筛选，酵母细胞文库的甘油菌可以用maiting法筛选，可以根据老师的实验习惯自由选择，结果没有差异。※.
9.3.如何检验图书馆质量？
文库质量的一个简单金标准是样本中的基因全部在文库中，如果有一半以上的全长基因，文库合格。※.
对于库的检测，我们可以对我们交付的产品做以下测试。※:
根据老师的样本信息，选择3-5个低拷贝基因，设计合成引物，以我们提供的文库质粒为模板，进行PCR扩增。如果低拷贝基因都能扩增，高拷贝基因就不会丢失，文库质量就可以判定为合格。
对于我们提供的大肠杆菌文库中的甘油菌，可以采用梯度稀释进行平板培养，第二天计算文库容量，同时选择单克隆进行PCR扩增和测序检测，判断插入片段的长度和空率。※.
9.4.如何评价图书馆质量？
文库质量的关键指标是文库容量、空率和插入片段的平均长度。※.
库的原始存储容量必须尽可能高。我公司承诺大于1 * 10 7的存储容量，这是原始存储容量，即不经过任何放大过程直接转换的存储容量。※.相比其他公司承诺的1 * 10 6的库容量，高出10多倍。下面详细说明图书馆容量对图书馆质量的影响:
除低等生物外，生物样品中基因的数量约为5 * 10 4，文库至少要覆盖100次，即存储量至少要达到5 * 10 6。※.
对于植物样本来说，基因的数量远大于人类，比如水稻样本是人类的2-3倍，小麦样本是人类的5-6倍，所以需要更多的库容量。※.对于水稻样本，需要覆盖100倍的基因数，需要的原始库容量大于1 * 10 7。市面上其他公司提供的库最多只能覆盖10次左右。如此低的覆盖率必然导致大量基因的丢失。
对于一些公司来说，图书馆容量越高越好，这是绝对不负责任的，为图书馆质量不合格制造不合理的借口。※.
至于插入基因的长度，其他公司平均长度在800bp左右，我们公司可以承诺做到1200bp以上，差距巨大。这里将详细介绍插入片段长度对文库质量的影响。※:
通常，功能基因的长度将超过200个氨基酸，即编码区将超过600bp。除了编码区，还有5’UTR区，3’UTR区和polyA区。总的来说，该基因的长度至少为1000bp。※.因为文库是混合物，会有竞争抑制，短基因太多必然会影响长基因的比例和长基因的表达丰度。
我们文库产物中插入片段的平均长度会在1200bp以上，最短的会在1000bp左右。※.对于文库筛选，并不意味着只需要一个基因片段。蛋白质的功能需要多种因素的参与。如果插入的基因太短，筛选出来的结果只是一个基因片段，甚至是polyA附近的一个短基因。这个结果的可行性在哪里？基本上可以认为是假阳性结果。
※对于一些公司来说，声称文库中基因插入片段的长度不是越长越好，这其实是对客户极其不负责任和不合理的欺骗，只是因为他们没有技术达到更长的片段长度。
9.5.交配和* * *哪个好？
* * *转化和maiting的结果是一样的，但是将文库质粒转入酵母细胞的方法对后续的文库筛选没有影响，可以根据老师的实验习惯自由选择。