库尔特原理的发展历程
在第一阶段，华莱士希望将常规的红细胞计数工作转变为自动化操作的愿望导致了上述简单想法的提出，库尔特原理的定义，该原理的专利获得，得到美国国立卫生研究院的认可，并在美国的一次全国性研讨会上阐述了该原理。
第二阶段，库尔特兄弟专注于商业乐器的实用性，重点通过运营公司支持这种乐器的生产和销售。
在第三阶段，广泛研究了由传感孔的功能特性引起的体积测量误差。Kurt Brothers不断发展的公司找到了各种解决方案，从而开发出了一种越来越自动化的血液分析仪。在其他地方获得技术经验后，华莱士于1946年回到芝加哥，之后他邀请他的兄弟小约瑟夫·r·库尔特加入他的研究。
他后来回忆了他们在一个地下室实验室的工作:“第一种方法是计算通过毛细血管和光束的血细胞，就像计算走过走廊的人数一样。但是我们没有得到非常好的感应信号，我们问自己为什么。除了调节光束之外，还有没有其他方法通过细胞的传递动作产生电脉冲信号？”虽然我们当时不知道答案，但血细胞是绝缘体——所以我们通过调整电流而不是光束得到了解决方案。通过一个基本上简单的解决方案，Wallace将毛细管长度减少到1947中的最小值。
“一开始，我们没有多少钱。我们从烟盒里拿出一张玻璃纸，用加热的针扎了一个小洞。虽然这个小洞不会持续太久，但我们数了一些细胞。”通过橡胶圈将带小孔的玻璃纸固定覆盖在玻璃管的末端，将连接电源的两个电极分开，悬浮在离子介质和电流仪中的细胞流过带小孔的玻璃纸。该孔中细胞的液体位移(等于其自身体积)与通过该孔传导电流的两个电极之间的电压脉冲成正比。
库尔特兄弟发现，细胞与悬浮介质之间的电反差是用光电方法获得的电反差的10倍，通过产生的电压脉冲可以准确计数流过孔隙的悬浮液中的细胞。这一发现促使华莱士花了非常长的时间寻找愿意申请专利的律师。最后，在1948，欧文·西尔弗曼(Irving Silverman)被介绍给他，他认可了这个很有潜力的新方法。1949，提交了专利申请。
但是专利审查员也怀疑一个洞是否可以申请专利。幸运的是，他猜测如果能提供一些应用实例(而不是仅仅提供“轴向电流通过一个小孔和传感通道”的原理)，基于在一个狭窄的电流通道中传感粒子的原理可以获得一项专利。1描述了小孔中模拟的跨越悬浮流的通道，也描述了非圆形截面的小孔。另一个例子是用绝缘针寻找稳定悬浮液中通过的粒子；通过移动的针和与导电悬浮介质接触的另一个电极之间的电流脉冲来检测粒子的存在。于是定义了一个新的库尔特原理，并在50年前的10月20日，1953，授予了开创性的专利。试管内壁下部形成的小孔是该专利的第一个例子。
与此同时，库尔特兄弟继续他们的研究和开发，专注于使自动化可行。在沃尔特·霍格(约瑟夫服役时的朋友)的免费帮助下，库尔特兄弟组装了一个实验仪器(与海军研究局签署的合同项目):一个机械测量系统驱动受控量的细胞悬液流经一个小孔，同时一个连接装置向其提供电流，产生的信号脉冲由阈值可调的电压放大器感知。超过阈值的信号脉冲将触发脉冲计数器(伯克利科学模型410；贝克曼仪器公司(当时在加利福尼亚州里士满)。通过连续增加阈值和重复测试样本，可以手动记录细胞大小的累积分布。因为需要监测小孔是否部分堵塞，所以安装了示波器，可以同时监测信号脉冲和阈值的设定。
1956年，华莱士在个人技术论文中正式公布了库尔特原理。在新的计数器中，单个细胞通过悬浮液中的小而窄的电流路径，然后检测细胞和悬浮液之间各自电导率的差异。小而窄的电流路径类似于光学系统中的一束小光束。单个血细胞在液体中通过小电流路径时，会改变电路中的电阻，从而使通过电流路径后的电压降发生变化。小规模的电流路径和包含流过该路径的细胞的液流具有简单的结构。电流路径的边界是一个绝热容器内壁上的一个小的淹没孔口。”在图3中，浸没孔是穿孔圆板a上的中心孔
此后不久，美国国立卫生研究院发表了两份评估报告。8月和9月的报告都认为Kurt的方法提高了红细胞计数的准确性、有效性和方便性。发表其中一篇评测报告的期刊还做了一个新的库尔特计数器？第一个广告。另一份评估报告9认为颗粒大小分布的偏斜是由细胞重合引起的，并提供了一种人为的方法来校正重合引起的计数损失。它还包含白细胞计数的初步数据。
自动重要血液检查的可行性已经得到证明，但商业运作尚未开始。仍然很难牢固地固定小孔。10压力计(用于测量通过小孔后的悬浮物)中使用的水银也是一个值得关注的问题，实验计数器中的机械系统尤为重要。用于为孔提供激励电流的电压源对孔和用于悬浮细胞的介质的特性具有不可接受的敏感性。在美国国立卫生研究院进行的研究中，已经证实需要自动稀释仪来精确稀释样本。约瑟夫总结准备工作说:“我们知道还有很多问题，但我们已经知道一些有用的东西。”下一个十年即将开始，很快在新申请的专利中就会有这些问题的解决方案。库尔特计数器的核心是感应孔(见图3，晶圆A上的孔)，此时最受库尔特兄弟关注。对于许多潜在的应用，要求针孔的直径小于100 μm，并且尺寸和形状的容许公差非常小。直接在样品试管壁上打小孔重复性低，促使带孔玻璃圆板(形成毛细管横截面)实验。而用来固定晶圆的粘合剂是不成功的(无效)，如果在样品试管上焊接下孔，热量会使小孔变形。用作手表轴承的戒指宝石也进行了尝试，Hermann Foery(瑞士珠宝公司，位于瑞士洛迦诺)提供了实验宝石，用于制作早期的低噪音孔。与Sam Gutilla(美国伊利诺伊州芝加哥市Del Mar科学公司)合作，开发了一种将宝石焊接到样品试管上的方法。宝石上精确的柱状孔不受焊接的影响，为电流和样品悬浮提供了耐用的管道。
到1958年底，与环形宝石焊接的可互换样品试管(见图3中的B)申请了专利。在10中选择的宝石的厚度可以提供大约0.75的针孔的长度与直径的比率，这可以最小化基础专利4和美国国立卫生研究院研究9中提到的粒子重合。到1958，库尔特兄弟准备成立库尔特电子公司和库尔特销售公司。母公司最早的两名全职员工是小约瑟夫·r·库尔特(Joseph R. Kurt Jr .)和沃尔特·霍格(Walter Hogg)，他们提供长期志愿服务。起初，库尔特兄弟的父亲周末来公司兼职做秘书和会计，但此时他已经68岁了。他从铁路运营员的岗位上退下来，和儿子们一起干到1971。沃尔特是第一个在公司工作了20年的员工。被指定为发明人的美国专利比华莱士多(分别为95项专利和82项专利)。沃尔特也是公司里唯一一个比华莱士拥有更多专利的员工。
事后看来，1958是一个重要的起点。基尔比发明了振荡器，第一个集成电路。不久，诺伊斯和赫尔尼发展了平面技术，使微电子学迅速发展。Townes和Schawlow描述了微波激射器在光频下工作的要求。两年后，麦曼发现了激光。所有这些发展对新公司的未来起了决定性的作用。
一开始，厄尼·亚萨卡组装了原型14的复制品，也就是现在所说的A型库尔特计数器。，华莱士出售。为了用于工业用途15，样品台增加了一个搅拌器(见图4)。新公司需要马上关注的是一篇论文，证实脉冲幅度与粒子体积存在正相关关系。通过放置一个库尔特计数器？并且连接了具有双可变脉冲阈值的单通道脉冲高度分析器(PHA ), Kubitschek获得了第一微分粒度分布。这样一来，A型计数器的两个缺点就凸显出来了:第一，它的单个阈值需要通过不断提高阈值进行多次测试才能得到14和16的累积粒度分布，手动得到微分粒度分布需要大量的时间和计算。显然，非常需要粒度分析的自动化方法；第二个缺点是用于提供针孔电流的电压源使得脉冲幅度对特定针孔的大小、特定悬浮介质的电阻系数以及特定悬浮介质中温度引起的变化敏感，这使得精确计数和粒度分析变得复杂。
图4带工业样品台的库尔特计数器(图3)，如右图所示。样品台右上方的黑色圆形物体是搅拌电机，用于保持工业颗粒悬浮；计数血细胞时，搅拌器不会在样本架上使用。控制台从左到右包括一个机械计数器(高值数字用于慢速累加)、三个十进制计数器(低值数字用于快速累加)和一个示波器显示管。单阈值和针孔电流控制装置受显示控制。
在白细胞计数取得良好效果后，该公司在1960中引入了一种改进的仪器，旨在进一步精确测量细胞和颗粒大小。用电流源代替原来的电压源激励针孔，用双阈值电流灵敏放大器代替原来的单阈值电压放大器感知粒子脉冲。因此，B型库尔特计数器对那些限制A型计数器的因素不敏感，它的双阈值互锁形成一个可移动的通道，由一个顺序的四秒计时器控制。它所附的H型分布绘图仪20可以从100秒的样品操作中自动累积25个通道的差分粒度分布。C型库尔特计数器的研制也取得了进展——其原型包括12道脉冲高度分析器。它的350多个真空管可以加热公司的设施，而且体积庞大，搬运时需要拆卸。到1961，公司从芝加哥搬到佛罗里达州的海厄利亚，C型库尔特计数器小到可以放在桌面上。
在20世纪60年代，A型和B型计数器被证明在红细胞和白细胞的计数和大小测量中非常有用7，18，22–28(见评论25和27)，它们还被应用于微生物学和工业领域的粒度分析31。但同时也有担忧。在1959中，根据库尔特原理设计了一种商用仪器。在32 1960中，美国国立卫生研究院的研究中发现的不对称分布得到了证实。体积庞大的稀释器促使客户自己设计更好的仪器。1962，发现传感孔的长径比影响粒度分析的分辨率。一家公司(后来成为库尔特兄弟公司的竞争对手)申请了库尔特原理的衍生型号专利，而库尔特销售公司的一位主管本人申请了衍生样品管专利，他后来离开了库尔特公司，成为库尔特公司的竞争对手。此外，早期的血小板计数实验也遇到了意想不到的干扰，这种干扰显然来自于相位显微镜无法发现的小颗粒38。
Lushbaugh等人用A型库尔特计数器39和40连接100通道的PHA，增加了测量成本。很快，就有几家公司将专门制造的库尔特粒子传感器与商用PHA连接起来，可以提供多达512个通道。随着体积测量工具的可用性和复杂性的增加，使用手工工具测量各种细胞和颗粒的粒度分布变得越来越明显。华莱士评论道，“面对挑战也是好的，我们肯定会分享一些好处。”感应针孔(见图3穿孔盘上的针孔)是库尔特原理的核心，设计一个库尔特计数器自动弥补其功能特性成为首要任务。美国国立卫生研究院的研究注意到，传感针孔的灵敏度是几何针孔的3倍，这是激励电流流过样品容器和样品管中悬浮介质产生电场的结果(见图3)。测量系统产生的类似流体动力场使细胞(或颗粒)在通过传感孔径时与电场相互作用。对于两种针孔场，重要的粒子相互作用发生在包含传感针孔的敏感体积内，并以半椭圆形从针孔的入口和出口向外延伸到针孔直径的三到四倍的距离。
因此，通过释放与细胞相同体积的导电悬浮介质，每个细胞在其范围内扭曲电场-特别是当通过感测孔径时。因此，细胞的体积相当于孔隙的体积。小孔(一般为五万分之一)电阻的变化和通过小孔时电阻的微小变化产生信号脉冲，从而可以进行细胞计数和大小测量。为了实现精确计数和可重复的尺寸测量，要求通过小孔的悬浮流非常稳定。与离子流不同，由于悬浮介质的聚集性和粘性，悬浮流受到传感孔的表面惯性和边界层的影响。结果，这些成对的孔及其两个孔口产生微观几何反应50，并且在孔轴线的中心点周围产生不对称的动态流场。在出口孔中产生的环形流体将颗粒带回到小孔的感测体积中，这将产生二次脉冲并导致错误的颗粒计数结果。例如，在早期的血小板研究中，Walter Haug发现38遇到的错误粒子是重新进入感应体积的红细胞，第二次脉冲使它们再次计数为血小板。将颗粒带离出口孔的辅助流可以防止颗粒循环和二次脉动。
一直认为敏感体积的细胞同时通过微孔时，通过屏蔽粒子的脉冲会降低细胞计数，但计数的损失可以通过悬液中的细胞浓度进行统计预测。因此，单通道计数可以通过适当的电路自动校正61。这种方法是在D型库尔特计数器的最新版本中引入的。但是粒子同时通过产生的非典型脉冲也导致了粒径分布的加宽45，红细胞典型的粒径分布是不对称的39–41，44，62。在美国国立卫生研究院的研究中，9这种不对称被归类为粒子重合，但很快在其他细胞类型38和粒子大小分布31，63，64中发现。在提高测量体积的准确度后，确定红细胞的粒度分布为双峰40，465，438+0，65。这些分布假象都导致尺寸测量的分辨率降低。到了20世纪60年代后期，关于体积测量中错觉产生原因的研究迅速发展，28，30，44，45，49，65–78，几个研究所根据库尔特原理建立了实验系统。当颗粒在离轴不同径向距离处通过感应孔时，会出现麻烦的粒度分布假象。在低有效粒子浓度下，几倍孔长的小孔可以提高测量分辨率34，465，438+0，67，80，更小悬浮流周围的辅助流可以以流体动力学的方式集中通过轴附近小孔的粒子。在典型的颗粒浓度下，在小孔中心取样信号脉冲或根据持续时间选择信号脉冲可以大大提高体积测定的精度(见概述65，67，78，86–88)。研究微孔功能特性的一个重要成果是发明了第一个细胞分类器48，70，89–91，可以判断红细胞的双峰分布是事实还是假象。Fulwyler将Kurt的原理与喷墨技术相结合，并利用这一成果从单一分布模式中选择细胞。当选定的红细胞被重新调整大小时，结果显示原来的双峰形式是一种错觉。在这项研究的大发展中，库尔特计数器的模型随着电子学的发展而发展，同时用晶体管的F型和C型取代了A型。修改了样表，用J型分布式绘图仪代替了H型分布式绘图仪。1968下半年，出现了第一台全自动血液分析仪94-7参数S型库尔特计数器。。与此同时，晶体管T型库尔特计数器？而不是c型库尔特计数器？用于工业目的。在集成电路的基础上，1970推出了Z系列计数器。Channelyzer出现在1972？体积分析仪，同时出现了工业TA系列分析仪，它包括计数器和16通道PHA电路。不久之后，这些仪器开始使用微处理器。
华莱士经常评论1，“只要有用，人们就会买。”随着产品的不断改进，销量越来越大。2000年以后生产的Multisizer系列在工业、生物等领域具有不可替代的地位，因为该型号具有极高的分辨率，可以根据其新开发的DPP处理器独立分析单个粒子的脉冲信号，使得在整个过程中监测粒子或细胞的体积或粒径变化成为可能。脉冲处理器技术的诞生也为粒度分析仪领域增加了独特的过程监控功能(图5)。
图5: Multisizer 3 Coulter计数和粒度分析仪目前广泛应用于各行业。
库尔特原理的轴向实现方式至今受到广泛关注，但由于热噪声，减小其尺寸的努力遇到了瓶颈。原则上，第二种形式使用跨越悬浮流的激发和感测，从而可以感测更小的颗粒，但是以体积线性化为代价(基于孔和电极的选定形状)。库尔特原理第四阶段的发展是否包括上述内容，还是将新兴科技与现有技术相结合，还有待观察。
一个人很幸运有一个好老师。有幸与库尔特兄弟共事的人有两位导师。这篇简评文章是为了纪念优秀的兄弟们，他们总是喜欢努力，鼓励自己做得更好。