智能PCR cDNA合成试剂盒使用说明

答:SMARTTM cDNA合成技术以总RNA或Poly A+ RNA为模板，以修饰的oligo(dT)寡核苷酸为引物，在MMLV逆转录酶的催化下合成第一条链。当逆转录酶到达mRNA的5’末端时，逆转录酶的末端转移酶活性将在第一链cDNA的3’末端添加3-5个脱氧胞苷酸。智能寡核苷酸的3’末端含有延伸的鸟苷酸残基，其与富集的胞苷酸退火形成延伸的模板。然后用逆转录酶转化模板，以智能寡核苷酸为模板继续延伸。以这种方式合成的单链cDNA在3’端具有与SMART寡核苷酸互补的序列，在5’端具有与oligo(dT)引物互补的序列。这些序列用作下一步长距离PCR的引物合成位点。结果获得了全长序列丰富的双链cDNA。

问:智能套件系列的产品有什么区别？

答:智能cdna文库构建试剂盒用于从少量RNA样本中构建高质量的cDNA文库。该试剂盒包括智能cDNA合成和文库构建。TriplEx2或创建者供体载体pDNR-LIB。因为试剂盒是专门为文库构建设计的，类似于Clontech？PCR-选择？CDNA消减杂交试剂盒不能一起使用。

智能PCR cDNA合成试剂盒可以和Clontech一起用？PCR-选择？CDNA消减技术一起使用。总RNA不能直接用于减法实验，但可以用SMART PCR cDNA合成试剂盒扩增出高质量的cDNA，用于杂交实验。同样，少量的Poly A+ RNA也可以通过SMART PCR cDNA合成试剂盒进行扩增。当你只有有限的RNA样本时，智能cDNA也可以用来取代标准的Northern杂交，而不必进行虚拟Northern杂交。SMART PCR cDNA合成试剂盒包含SMARTⅱ寡核苷酸和cDNA合成引物，两种序列都具有使Clontech？PCR-Select减去所需的Rsaⅰⅰ位点。该试剂盒也可用于在其他自选载体中构建SMART cDNA文库。

SMART RACE cDNA扩增试剂盒结合了SMART cDNA合成技术和RACE方法。该试剂盒优点是可以构建全长cDNA，不需要接头连接，敏感性强，方法简单。

问:智能技术能否用于cDNA末端的快速扩增(RACE)？

答:是的。随着新的SMART RACE cDNA扩增试剂盒的进一步完善，SMART技术的所有优势都可以用在RACE方案中。

问:为什么智能cDNA合成过程中对PCR循环次数有一定的限制？

答:智能cDNA技术的一个独特之处是长距离PCR扩增步骤。为了保持SMART cDNA的基因表达，需要进行尽可能少的循环。如果循环数过高，扩增超过指数增长阶段，就会出现ssDNA的积累，不适合进行克隆或消减等cDNA后期操作。此外，循环次数越高，耐热聚合酶的错误概率越高，PCR的保真度越低。因此，为了获得高质量的cDNA，将循环数保持在批准的参数内是非常重要的。

问:SMARTTM库的特点是什么？

答:智能cDNA文库含有丰富的全长cDNA。插入片段的平均大小为1.5-2 Kb。我们从SMART文库中克隆的最大插入片段是大于6kb的β-肌球蛋白cDNA。即使初始材料是总RNA，核糖体RNA也几乎不会被筛选。实验结果表明，来自SMART cDNA文库的50个克隆没有显示核糖体RNA克隆。用50 ng总RNA或25 ng poly A+ RNA构建的SMART cDNA文库的基因保真度与通过标准Gubler和Hoffman方法用5 ug poly A+ RNA构建的文库相似。

问:为什么SMARTTM PCR扩增的cDNA中没有rRNA序列？

答:虽然在合成SMART第一链cDNA的过程中可以逆转录rRNA，但是这些序列在后续的PCR过程中不会被扩增。这是因为在大多数情况下，rRNA序列是通过自我指导进行逆转录的，所以最终的cDNA片段没有5’和3’SMART特异性序列，无法通过指数PCR进行扩增。

问:可用作SMART PCR cDNA扩增模板的最小RNA量是多少？

答:虽然我们可以用SMART技术从10ng总RNA构建文库，但我们建议原始材料至少应为50ng总RNA或25 ng Polya+RNA。从而保证SMART cDNA组的质量更高，基因代表性更强。

问:我可以改变SMARTTM寡核苷酸的序列吗？

答:寡核苷酸序列的任何改变都会影响cDNA合成和扩增的效率。Smart ⅱ和smart ⅳ很少。

糖苷酸的序列和设计受专利保护。

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