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哪些因素会影响目的基因在大肠杆菌中的表达？
推荐答案(1)外源基因的拷贝数
(2)外源基因的表达效率
①启动子强度
有效②核糖体结合位点的性别
③SD序列与起始密码子ATG的距离
④密码子
⑶表达了产品的稳定性。
(4)细胞代谢负荷
⑸工程菌的培养条件
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建立载体，目的基因在植物的根和根细胞外表达分泌。请注明步数:842奖励积分:20 |解决问题。
时间:2009年2月-14 09: 13 |提问者:370 629 225
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植物遗传转化的最终目的不是建立特定外源基因的植物表达载体，并将其转移到受体植物中。理想的转基因植物通常需要外源基因在特定的地点和特定的时间高水平表达，人们期待表型性状。但在近二十年的发展过程中，往往表达效率低下，表达产物不稳定，甚至基因失活或沉默，使得转基因植物的外源基因无法在受体植物中投入实际应用。此外，转基因植物的安全性已经引起了许多国家的关注，例如转基因植物的花粉传播，抗生素选择标记基因可能会使一些抗生素在临床上无用。这种高科技植物基因工程的出现，正以前所未有的时期困扰着上述问题。为了解决这些问题，近年来，人们纷纷种植转基因技术，而广泛的植物表达载体的探索和改进、改良和优化是其中最重要的内容之一。综述了本文的研究进展。
外源基因表达水平的1启动子的选择和转化往往是转基因植株不理想的重要原因。启动子在基因表达中起着关键作用。因此，选择合适的植物启动子来提高其活性是提高外源基因表达首先要考虑的问题。
在这种植物表达载体中，广泛使用的启动子是组成型启动子，例如，大多数双子叶植物使用的CaMV35S启动子，单子叶植物使用的泛素启动子，以及水稻使用的Actinl启动子。外源基因处于启动子的控制之下，在这些元件中表达，在转基因植物的所有部分和所有发育阶段表达。但外源基因在受体植物中的表达是持续有效的，不仅造成浪费，而且往往会引起植物的形态变化，影响植物的生长发育。为了有效地发挥植物的作用，同时减少植物的不良影响，特异表达启动子的外源基因的研究和应用越来越受到重视。已经发现，包括器官特异性启动子在内的特异性启动子诱导特异性启动子。例如种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子被破坏、化学诱导特异性启动子的光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。特异启动子的克隆为外源基因在植物中的表达奠定了基础。比如瑞士的CIBA-盖基PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒素基因的表达，启动子水杨酸及其衍生物诱导酒精喷洒，廉价无污染，诱导有抗性基因表达的害虫在这个季节再次发生，显然是非常有效的方法。
在植物转基因研究中，往往得不到满意的结果，尤其是在利用天然启动子进行特异性表达和诱导表达方面，表达水平大多不理想。改造现有启动子，构建复合启动子将是一个非常重要的途径。比如Ni的转录激活区章鱼碱合成酶基因和甘露碱合成酶基因的启动子等。GUS表达的结果表明，修饰的启动子的活性比35S启动子的活性显著提高。吴瑞等人通过操纵诱导型PI-II基因启动子的水稻Actinl内含子组合，将新表达的启动子活性提高了近10倍(专利)。在植物基因工程的研究中，这些人工合成的启动起了重要的作用。
构建载体提高外源基因翻译效率，通常是基因修饰，主要考虑三个方面:
2.1提高5’-3’-非翻译序列的翻译效率
许多实验发现，真核基因的5’-3’-非翻译序列(UTR)的正常表达是非常必要的，而该区域mRNA的稳定性和翻译水平往往会显著降低。如烟草花叶病毒(TMV)126 kda蛋白基因翻译起始位点上游由一个68bp的核苷酸ω元件组成，提供了一个新的核糖体结合位点，使Gus基因的翻译活性提高了几十倍。有许多载体在外源基因的5’-末端带有ω翻译增强子序列。Ingelbrecht讲述了已经研究过的各种基因的3’-末端序列，发现章鱼碱合成酶基因的3’-末端序列使NPTII基因的瞬时表达增加了20倍以上。此外，不同基因的基因表达增强效率在促进基因表达方面是不同的，例如RBCs 3’-末端序列的3’-末端序列是3’-末端查耳酮合酶基因的60倍以上。
2.2优化起始密码子周围的序列
尽管起始密码子在生物圈中是常见的，但不同生物来源的基因都有其特殊的外部起始密码子序列。例如，植物起始密码子周围的序列的典型特征是AACCAUGC，动物起始密码子周围的序列CACCAUG与原核生物中的序列有很大不同。科萨克对ATG相邻定点突变的作用、起始密码子的转录和翻译进行了详细的研究，并得出结论:ACCATGG周围最有效序列在真核生物中的转录和翻译，尤其是-3 A的进入效率非常重要。构建购买的序列，称为科萨克序列，用于表达载体。例如，细菌几丁质酶基因的表达水平，以及原始起始密码子周围的序列UUUAUGG，在烟草中增加了8倍。因此，使用来自非植物来源的基因构建体的表达载体应基于待转化植物起始密码子周围序列的特征。
2.3基因的编码区是转化。
如果外源基因来自原核生物，由于表达机制的差异，这些基因在植物中的表达水平往往很低。例如，来自苏云金芽孢杆菌野生型的杀虫蛋白基因在植物中的表达非常低。发现原核生物和植物基因mRNA稳定性的差异是由于降低。孟山都公司Perlak的前提下，氨基酸序列不变的毒蛋白，杀虫蛋白的基因转化，植物的密码子选择，GC含量，删除原序列中影响mRNA稳定性的元素，结果，毒蛋白在转基因植物中的表达量增加了30到100倍。
三
消除位置效应去除外源基因后，受体植物在不同的转基因植物中通常具有非常不同的表达水平。这是外源基因在受体植物基因组中具有主要不同插入位点的结果。这就是所谓的“位置效应”。为了消除位置效应，外源基因是植物基因组在转录活性区的表达载体。目前的构建策略通常考虑核基质结合区的整合和定点整合技术。
核基质结合区(MAR)是一种DNA序列，其中结合了真核细胞染色质核基质的特定部分。一般MAR序列位于转录活性DNA的环状结构中，其作用是使分裂功能，使每个转录单位受周围染色质的影响而保持相对独立的边界。本研究表明，将MAR两侧含有MAR基因的结构遗传转化到植物表达载体中所需的基因构建，可以显著提高目的基因的表达水平，减少不同转基因植物之间表达水平的差异，降低该效应的位置。例如，Allen等人研究了异源MAR(来自酵母)和同源MAR(来自烟草)Gus基因在烟草中的表达，发现酵母MAR可以使转基因表达的平均水平提高12倍，烟草MAR本身可以使转基因表达的平均水平提高60倍。MAR的鸡溶菌酶基因也能起到同样的作用。
另一个可行的方法是使用面向站点的集成技术。该技术的主要原理是改造载体宿主的染色体，通过外源基因的同源重组，将特定DNA片段的同源区域整合到染色体上。实际上，当第一个分离的染色体转录活性区的DNA片段时，就构建了植物表达载体。同源重组微生物的靶向整合已成为常规的基因操作，植物中外源基因的叶绿体表达载体在动物体内也已成功整合，但核转化方法的靶向外源整合成功案例较少。
4.叶绿体表达载体的构建
外源核转化往往是为了克服基因表达。由于不安全的性行为问题，如核基因花粉传播的位置效应，近几年才出现的一种新的遗传转化技术——叶绿体转化，正是其优势和发展前景，越来越受到人们的认可和重视。到目前为止，已经发表了五种叶绿体转化烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜(侯炳凯等。)，这使得这项转化技术成为植物基因工程中新的增长点。
经测定，各种植物叶绿体基因组序列的外源基因定点整合到叶绿体基因组中，为同源重组机制奠定了基础，目前构建的叶绿体表达载体基本属于特定网站的整合载体。叶绿体表达载体的构建基本上是一个实例载体。生成叶绿体表达载体的通用外源基因的表达盒，每个连接时期的叶绿体DNA序列的两侧被称为同源重组片段，或定位片段(定向片段)。当载体导入叶绿体时，两个片段在叶绿体基因组中有相同的同源重组片段，是外源基因整合到叶绿体基因组中的特异场所。以作物改良为目的，叶绿体转化需要同源重组，插入外源基因的叶绿体基因组原始序列不会造成丢失，也不会破坏原始基因的插入点。为了满足这一要求，已有的工作选择了两个相邻基因的同源重组片段，如rbcL基因/ACCD 16 strnv/rpsl 2 PS 7 psba基因/变体1，rps7/ndhB。指定的外源基因发生同源重组后，插入相邻的两个基因区间，保证基因原有的功能不受影响。最近，Daniel等利用烟草叶绿体基因组tRNA和trnI的同源重组片段，构建了* * *相同载体(universal vector)。在高等植物中，因为tRNA和trnI DNA序列是高度保守的，所以作者建议这种载体可用于各种植物的叶绿体转化。如果该载体的通用性得到证实，那么这项工作无疑是构建一个新的、方便实用的叶绿体表达载体的一个好主意。
整合到叶绿体基因组中的外源基因的表达往往是由于叶绿体基因组的高拷贝数。在第一个例子中，McBride等人将Bt的cryIA(c)毒素基因导入烟草叶绿体BT毒素蛋白的叶片中的效率高达3%至5%，而典型的核转化技术只能实现0.001%至0.6%的总蛋白表达。最近，在Kota Kinna，Bt Cry2Aa2基因被导入烟草叶绿体。还发现烟草叶片中毒性蛋白的表达量占可溶性蛋白的2% ~ 3%，比核转化高20 ~ 30倍。转基因烟草不仅抗敏感虫，还杀死了高抗虫的。Staub最近报道，导入烟草叶绿体的人生长激素基因表达量高达叶蛋白的7%，是核转化法的300多倍。这些实验充分构建和转化叶绿体表达载体，是实现外源基因高水平表达的重要途径。
5定位信号应用程序
上述载体优化策略的主要目的是提高外源基因的转录和翻译效率。但是，外源蛋白能否在植物细胞中稳定高水平表达，其他重要问题需要考虑植物遗传转化的积累。
最近的研究发现，如果某个外源基因被正确地定位在相连的信号序列中，该外源蛋白就可以被定向转运到细胞中的特定位点，如叶绿体、内质网、液泡等。，可以显著提高系统的稳定性和外源蛋白的积累。这是因为某个特定的区域吗？某些外源蛋白的内质网提供了一个相对稳定的环境，可以有效阻止外源蛋白的降解。例如，在Wong等人的拟南芥Rubisco亚基的转运肽序列与具有特殊杀虫蛋白的转基因烟草叶绿体中积累的杀虫蛋白基因连接之前，外源蛋白的总积累比对照组高10至20倍。最近，梁野，王松汝嫣的rbcS亚基转运肽序列与前PHB合成基因连接，试图使基因产物在转基因油菜种质中积累，从而增加外源蛋白含量。、Wandelt和Stern连锁内质网，发现外源蛋白基因的序列(四肽KDEL的编码序列)显著提高了转基因植物中外源蛋白的含量。显然，定位信号对蛋白质的积累起到了积极的促进作用，但同一定位信号是否适用于所有的蛋白质还需要进一步确定。
6内含子增强基因表达内含子增强基因表达。Callis等人首先发现了转基因玉米。玉米乙醇脱氢酶基因(ADHL)的第一内含子(内含子1)显著增强了外源基因的表达，其他内含子(如内含子9)也有一定的促进作用。后来vasil Lev也发现了第一个内含子，玉米果糖合成酶基因CAT的表达水平提高了10倍。第三个内含子，水稻肌动蛋白基因，也可以由2？报告基因的表达水平增加了6倍。枣内含子增强基因表达的机制尚不清楚，但一般认为内含子的存在可以提高加工效率和mRNA的稳定性。Tanaka等，有研究表明内含子对基因表达的增强作用主要发生在单子叶植物和双子叶植物中，并不明显。
由于内含子的增强，mcelroy构建了单子叶植物表达载体，特别是水稻肌动蛋白基因的第一个内含子维持了启动子下游基因的表达。类似地，将Christensen等人构建的玉米泛素第一内含子的基因置于启动子下游，以提高外源基因在单子叶植物中的表达。但有人指出，启动子强度、细胞类型、目的基因序列等因素对基因表达的影响取决于特定内含子的功能，有时甚至取决于内含子在载体中的位置。例如，玉米ADHL基因9位于GUS基因的5’末端，并且在Gus基因的CaMV35S启动子的控制下不被增强。内含子的3’端放入内含子gus基因，在同一起始子的gus基因表达水平控制下，增加了约3倍。内含子的基因表达机制可能非常复杂。可见，如何建立内含子的高效植物表达载体缺乏固定的模式，值得进一步研究。
多基因控制政策
到目前为止，大多数是通过引入单一外源基因对受体植物进行遗传转化的研究。但足够强大，有时由于单个基因的表达或单个作用机制，理想的转基因植物并没有得到。如果两个或两个以上的基因对植物有协同作用，同时，会获得比单个基因更好的转化结果。这一策略已被应用于培育具有抗病性、抗虫性和抗逆性的转基因植物。比如根据昆虫谱和抗虫基因功能的不同机制，构建两个功能互补的载体，通过某种方式将两个抗虫基因导入植物。王伟与其他凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因一起被同时转移到棉花中已经含有二价抗虫基因的转化植株中。巴顿Bt杀虫蛋白基因和蝎毒素基因导入烟草，大大提高了抗虫性和防止害虫产生抗药性的能力(专利)。利用强大的抗病性，我们在兰岩的实验室构建了含有β-1，3-葡聚糖酶双价基因和几丁质酶基因的植物表达载体，并将其导入油菜和棉花中。结果表明，转基因植株具有明显的抗性。最近，冯道荣、李宝健2？三个抗真菌基因和hpt基因甚至在载体上，抗虫基因和bar基因是否连接在另一个载体上，基因枪一起导入水稻的结果显示，R的后代70%含有导入的外源基因(6？7)，以及导入的外源基因的一个或两个基因组位点整合的趋势。
一般来说，将25KB以上的外源DNA片段导入植物细胞是不可能的。功能相关基因，如植物抗病基因中的数量性状位点，主要以基因簇的形式存在。如果将一些大于100KB的DNA大片段，如天然植物染色体基因簇或非相链中的一系列外源基因导入植物基因组中的同一点，就可能出现由多个基因控制的现象。优良性状可能产生广谱抗虫和抗病，可以获得全新的代谢途径，在受体细胞中产生新的生物分子。此外，基因簇的大片段或基因簇的同步插入也可以在一定程度上克服转基因引起的位置效应，减少基因沉默等不良现象的发生。最近，Hamilton和Alfred开发了新一代载体系统，克隆了大的DNA片段，并在农杆菌的帮助下直接转化了植物BIBAC和TAC。这两个算子不仅要加快基因的图谱克隆，还要控制多个基因，品种改良才会有潜在的应用。目前在多基因转化中的应用研究才刚刚开始。在BIBAC和TAC载体上
8选择使用和缺失的标记基因
标记基因的选择遗传转化中可转化的细胞(或个体)从大量未转化细胞中选择的标记基因。它们通常能使产生的转基因细胞具有对选择子产物的抗性。因此，添加了这种选择的正常生长培养基中的转基因细胞，由于缺乏抗性，而不是生长、发育和分化，表现出这种选择剂的敏感性。在载体中，构建并选择标记基因的连接侧，两者都有自己的基因调控序列(如启动子、终止子等。).有两种主要类型的选择标记基因:抗生素抗性基因和除草剂抗性基因。前者会产生抗生素抗性，后者会产生抗药性除草剂。使用的抗生素抗性基因包括NPTII基因(潮霉素抗性)、产生潮霉素磷酸转移酶的Gent基因(新霉素磷酸转移酶、卡那霉素抗性)和HPT基因(产生抗庆大霉素ADM)。除草剂抗性基因，包括EPSP基因(产生5-丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，草甘膦)、GOX基因(通过草甘膦氧化酶降解草甘膦)和bar基因(产生PPT乙酰转移酶、抗双丙氨膦或草铵膦)。
上面的1，2，3，5，6都是可圈可点的，特别是因为你可以选择PB I121作为胞外分泌骨架载体，然后你可以在上面改变基因型。
克隆步骤相对简单。
1，第一个限制性酶切位点，以获得所需的基因，并且是上传变化的良好载体。
2质粒转化大肠杆菌DH5α扩增
用扩增良好的质粒转化植物细胞
4.收集细胞外培养液检测蛋白的表达和分泌。是否
至于转化的载体，简单说几句就可以了。答完了，如果真的做好了载体，就可以开自己的公司了。