DNA指纹技术使用酶切割成片段。用的是什么酶？
限制性核酸内切酶:一种识别并切割特定双链DNA序列的核酸内切酶。
[别名]内脱氧核糖核酸酶
【酶反应】限制性内切酶可以在有限数量的特定位点分裂DNA分子。它能识别外来DNA并将其降解。
【单位定义】在指示的pH和37℃下，0.05mL反应混合物中，消化1μgλDNA 1小时的酶量为1单位。
【性状】产品不含非特异性核酸水解酶(10单位内切酶与1μg λDNA孵育16小时后得到的凝胶电泳图谱的稳定性)。
限制性核酸内切酶的命名；一般由属名首字母和种名前两个字母组成，第四个字母表示品系(品系)。例如，从解淀粉芽孢杆菌H中提取的限制性内切酶称为Bam H，从同一株细菌中获得的识别不同碱基序列的几种特异性不同的酶，可以编码成不同的编号，如HindIII、hindiii、HpaI、HpaII、MboI、MboI等。
生物体内有一种酶，可以切断外源DNA，即可以限制外源DNA的入侵，使其失去活力，但对自身DNA没有损伤，从而保护细胞原有的遗传信息。因为这种切割是在DNA分子内部进行的，所以称为限制性内切酶(简称限制性内切酶)。限制性内切酶是基因工程中一种重要的切割工具。科学家从原核生物中分离出多种限制性内切酶，并已商业化，广泛应用于基因工程。根据限制性内切酶切割的特点，可分为两类:一类是切割位点不特异；另一种是核苷酸序列可以被特异性识别，即只能在某个DNA序列上切割。所有能被特异性识别的切割位点都有回文序列，即在切割位点，一条链正向读出的碱基序列与另一条链反向读出的碱基序列完全相同。后一种酶主要用于基因工程。限制性内切酶在特定切割位点切割时，根据切割方式可分为错位切割和平切。位错解理通常在两条链的不同部分切割，它们之间有几个核苷酸。切割后两端形成回文单链末端，可以用互补碱基与目的基因的DNA片段连接，故称为粘性末端。这种酶最常用于基因工程。另一种是将两条链的特定序列的相同部分切开，形成不粘端的扁口。
在基因操作的过程中，除了限制性内切酶之外，还需要一系列的酶来完成整个过程。例如碱性磷酸酶、DNA聚合酶、末端转移酶、多核苷酸酶、逆转录酶等。这些酶都有自己特殊的催化功能，现在都有售，可以根据不同的需求进行选择。
简短定义:
DNA限制性核酸内切酶:
一种识别并分解生物体中特定双链DNA序列的核酸内切酶。它是一种可以切断外源DNA的酶，即可以限制外源DNA的入侵，使其失去活力，但对自身DNA没有损伤，从而保护细胞原有的遗传信息。因为这种切割是在DNA分子内部进行的，所以称为限制性内切酶(简称限制性内切酶)。
限制性核酸内切酶综述
(限制性核酸内切酶:概述)
30多年前，当人们在研究噬菌体的宿主特异性限制修饰现象时，限制性内切酶首次被发现。细菌可以抵抗新病毒的入侵，这种“限制”病毒存活的方法可以归结为细胞内部的限制性内切酶可以破坏外源DNA。发现的第一批限制性内切核酸酶包括来自大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来自流感嗜血杆菌的Hind II和Hind III。这些酶可以在特定的位点切割DNA，产生可以在体外连接的基因片段。研究人员很快发现，核酸内切酶是研究基因组成、功能和表达的非常有用的工具。
当70年代限制性内切酶的应用普及后，以NEB为代表的很多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了一些病毒，限制性内切酶只存在于原核生物中。人们正在从成千上万的细菌和古细菌中寻找新的限制性内切酶。对测序的原核生物基因组数据的分析表明，限制性内切核酸酶在原核生物中普遍存在——所有自由生活的细菌和古菌似乎都能够编码限制性内切核酸酶。
限制性内切酶有多种形式，可以小到Pvu II(157个氨基酸)，也可以大到Cje I的1250个氨基酸。在已被纯化和分类的3000多种限制性内切酶中，发现了250多种特异性识别序列。其中30%是在NEB中发现的，对特异性识别序列未知的限制性内切酶的研究仍在继续。同时，人们利用计算机分析已知的基因组数据，以便有更多的发现。尽管许多新发现的酶的识别序列与现有的-纯合酶重复，但仍有酶识别新的位点。
20世纪80年代，NEB开始克隆和表达限制性内切酶。克隆技术将限制性内切酶的表达与原始细胞环境分离，避免了原始细胞中其他内切酶的污染，从而提高了酶的纯度。此外，克隆技术提高了限制性内切酶的产量，简化了纯化过程，显著降低了生产成本；克隆的基因很容易测序和分析，表达的蛋白质也可以通过X射线结晶分析，这使我们对克隆的产品更加肯定。
限制性核酸内切酶I限制和修饰
1.限制和修改现象
早在20世纪50年代初，许多学者就发现了限制和修饰现象，当时称之为宿主控制特异性。L噬菌体的现象具有代表性和普遍性，它在不同宿主中的转染频率可以说明这个问题(表2-1)。l感染一个宿主后，会被限制感染其他宿主。
大肠杆菌λ噬菌体的感染率
lK lB lC
大肠杆菌K 1 10-4 10-4
大肠杆菌B 10-4 1 10-4
大肠杆菌C 1 1 1
说明K和B菌株中存在一个限制系统，可以排除外源DNA。10-4的存活率是宿主修改系统的结果，限制系统还没起作用。然而，在菌株C中，来自菌株K和B的DNA不能被限制。限制实际上是一种保护机制，限制酶对外源DNA的降解，维持宿主的遗传稳定性。甲基化是一种常见的修饰，可以使腺嘌呤A变成N6甲基腺嘌呤，胞嘧啶C变成5 '甲基胞嘧啶。通过甲基化，我们可以识别自己的遗传物质和外来的遗传物质。
2.限制酶的发现
20世纪60年代，人们注意到DNA感染宿主后会发生降解，并由此提出了限制性内切酶和限制性内切酶的概念。在1968中，首次从大肠杆菌K中分离出限制酶。它有一个特异的识别位点，但没有特异的切割位点，切割位点距离识别位点超过1000bp。
1970年，美国约翰霍普金斯大学的H. Smith偶然发现流感嗜血杆菌能快速降解外源噬菌体DNA，其细胞提取液能降解大肠杆菌DNA，但不能降解自身DNA，从而找到了Hind限制性内切酶。Hind限制性内切酶位点和切割位点如下:
5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '
3 '…卡普↑ PyTG … 5 '
此后，越来越多的限制性内切酶被发现，其中许多已被应用于实践。EcoRⅰⅰ是应用最广泛的限制性内切酶，其切割位点如下:
5' G↓AATTC 3 '
3' CTTAA↑G 5 '
限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要取决于来源，涉及宿主的名称、菌株编号或生物型。命名时，取宿主属名的第一个字母，种名的前两个字母，菌株号，然后加上序号(罗马)。如Hindⅲⅲ限制性内切酶，Hin指流感嗜血杆菌，d指菌株Rd，iii指序列号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加R或M，菌株号和序号小写。但是现在限制性内切酶名称中的R被省略了。
在1986的后半部分，发现了615种限制酶和98种甲基化酶。在1998中发现10000种细菌或古细菌中有3000种酶，酶具有200多种特异性。到2005年6月5438+10月，* * *已发现4342种限制酶和甲基化酶，其中3681种限制酶，包括59种ⅰ型限制酶，3612和10种ⅲ型限制酶，3种甲基化定向限制酶和3种商品化限制酶。
3.限制和修改系统的类型
根据酶的亚基组成、识别序列的类型以及是否需要辅助因子，限制和修饰系统至少可以分为四类。表2-2是各种限制和修改系统的比较。
ⅱ类限制和修饰系统占比最大，达到93%。ⅱ型酶相对简单。它们识别回文对称序列，切割回文序列内部或附近的DNA，产生带有3’-羟基和5’-磷酸基团的DNA产物。它们的活性需要Mg2+,而相应的修饰酶只需要SAM。识别序列主要为4-6bp，或更长且双对称，但少数酶识别更长的序列或简并序列，酶与酶之间切割位置不同，有的是分离的。
ⅱs型的限制修饰系统占5%，与ⅱ型有相似的辅因子要求，但识别位点不对称、不连续，长度为4-7bp，切割位点可能在识别位点一侧20bp以内。
ⅱ型限制性内切酶一般为同二聚体，由两个相同的亚基以相反方向结合在一起组成，每个亚基作用于DNA链的两个互补位点。修饰酶是一个单体，修饰一般由两个甲基转移酶完成，分别作用于其中一条链上，但两条链上的甲基化碱基是不同的。
还有一种特殊类型的ⅱ型限制酶，只切割双链DNA的一条链，产生一个缺口。这种限制酶也叫切口酶，如N.Bst NBI。
ⅰ型限制和修饰系统类型较少，仅占1%，如EcoK和EcoB。它的限制性酶和甲基化酶(即R亚基和M亚基)在酶分子中各作为一个亚基存在，还有一个负责识别DNA序列的S亚基，分别由hsdR、hsdM和hsdS基因编码，属于同一个操纵子(转录单位)。EcoK编码基因的结构为R2M2S。EcoB编码基因的结构为R2M4S2。
EcoB酶的识别位点如下，其中两条链中的A为甲基化位点，N代表任意碱基。
TGA*(N)8TGCT
EcoK酶的识别位点如下，其中两条链中的A是可能的甲基化位点。
AA C(N)6GTGC
而EcoB和EcoK酶的切割位点在1000bp的识别位点之外，没有特异性。
ⅲ型限制和修饰系统类型较少，占1%以下，如EcoP1和EcoP15。它们的识别位点分别是AGACC和CAGCAG，切割位点在下游24-26bp。
在基因操作中，一般来说，限制酶或修饰酶是指II型系统中的类型，除非另有说明。
表2-2:各种限制和修改系统的比较
Ⅱ Ⅰ Ⅲ
酶分子
内切酶和甲基化酶
分子不在一起。
三乙烯双功能酶
双亚单位双功能酶
识别部位
4-6bp，多为回文对称结构。
二分法不对称
5-7bp不对称
切割位点在识别位点内或附近。
无特异性，识别位点外至少1000bp。
识别位点下游24-26bp。
限制性反应和甲基化反应
单独反应
互相排斥
同时竞争
ATP是否需要用于限制？
不
是
是
二、限制性内切酶识别的序列
1.限制酶识别序列的长度
限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的序列为6个碱基(表2-3)。当识别序列为4和6个碱基时，当它们能识别的序列完全随机时，平均每256和4096个碱基会出现一个识别位点(4 ^ 4 = 256，4 ^ 6 = 4096)。以下是几种有代表性的类型，箭头表示切割位置。
四个碱基识别位点:Sau3Aⅰ↓GATC
五个碱基识别位点:EcoRⅱ↓CCW gg
NCIⅰCC↓SGG
六个碱基识别位点:EcoRⅰG↓AATTC
hindⅲA↓AGC TT
七个碱基识别位点:BbvCⅰCC↓TC AGC
PpuMⅰRG↓GWCCY
八个碱基识别位点:NotⅰGC↓GGCCGC
SFIⅰGGCCNNNN↓ng gcc
上述序列中某些字母所代表的碱基如下。
R=A或G Y=C或T M=A或C。
K=G或T S=C或G W=A或T。
H=A或C或T B=C或g或T V=A或C或g。
D=A或g或T N=A或c或g或T
2.限制酶识别序列的结构
限制性内切酶识别的序列大多是回文对称结构，切割位点在DNA两条链的对称位置。EcoRⅰⅰ和Hindⅲⅲ的识别序列和切割位置如下。
EcoRⅰG↓AATTC HindⅲA↓AGC TT
CTTAA↑G TTCGA↑A
有些限制酶的识别序列是不对称的，如AccBSⅰ[ccg CTC(-3/-3)]和BssSⅰ[CTC GTG(-5/-1)]。识别序列后括号中的数字表示两条链上的切割位置。
AccBSⅰCCG↓CTC BssSⅰC↓TCGTG
GGC GAG GAGCA C
一些限制酶可以识别多个序列。比如AccⅰI识别的序列是GT↓MKAC，也就是说可以识别四个序列，其中两个是对称的，另外两个是非对称的。Hindⅱⅱ识别的序列是GTY RAC。
一些限制酶识别的序列是不连续的和对称的，对称序列之间有几个任意的碱基。如AlwNⅰⅰ和Ddeⅰⅰ，它们的识别序列如下。
AlwNⅰCAGNNNC↓TG DdeⅰC↓TNAG
GT↑CNNNGAC GANT↑C
3.限制酶切的位置
限制性内切酶对DNA的切割位点大多在里面，但也有一些在外面。在外面，有两端，两边和一边。两端切线分别是Sau3ai (↓ gatc)、Nlaⅲ(CATG↓)和Ecorⅱ(↓ccwg)等。两边都有BCGⅰ[(10/12)CGA(n)6 tgc(12/10)]和TSPR ⅰ (castgnn ↓)。卡介苗ⅰ的切割特性不同于其他酶，它们在识别位点的两端切割一个断点。还有BBV ⅰ [GC AGC (8/12)]和BSPM ⅰ [acctgc (4/8)]它们的切线在识别位点之外。
BCGⅰ↓10(N)CGA(N)6 tgc(N)12↓TspRⅰnn CAC(G)TGNN↓
↑12(N)CGA(N)6a CG(N)10↑NNGTG(C)ACNN
第三，限制产酶的终点
1.限制酶产生匹配的末端。
识别位点为回文对称结构的序列被限制性内切酶切割，得到的末端是一个匹配的粘性末端，即粘性末端，这样形成的两个末端是相同且互补的。如果在对称轴的5’侧切割底物，DNA双链交替断裂产生5’突出的粘性末端，如Ecorⅰ；如果在3’端切割，会产生一个3’突出的粘性末端，如Kpn。
NNG一号NNG
GNN·GNN
2.限制酶产生平端。
在回文对称轴上同时切割两条DNA会产生平端，如hae ⅲ (gg ↓ cc)和EcoRV(GAT↓ATC)。末端为平端的DNA可以随意连接，但连接效率低于末端为粘端的DNA。
3.限制酶产生不对称突出端
许多限制性内切酶切割DNA产生不对称的突出端。当识别序列不对称时，切割的DNA产物末端不同，如BbvCⅰⅰ，其识别切割位点如下。
CC↓TCAGC
GGAGT↑CG
一些限制酶识别简并序列，一些识别的序列是不对称的。如Accⅰⅰ，其识别裂解位点如下，其中GTAGAC和GTCTAC不对称。
GT↓AT/CGAC
CATA/GC↑TG
有些限制酶识别间隔区序列，间隔区序列是任意的，如Draⅲⅲ和Earⅰⅰ。