靶向载体制备敲除小鼠的原理是什么？

生物学中同源重组的发现为基因打靶奠定了坚实的理论基础，胚胎干细胞技术的发展促进了基因打靶的广泛应用。同源重组又称一般重组或非特异性重组，是指相似DNA交换遗传信息的过程，外源DNA片段可以与宿主基因组的相应片段进行交换(即重组)。基因打靶通常是指将已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中具有相同或相似序列的基因进行同源重组，整合到受体细胞基因组中并表达的外源DNA导入技术。

主要策略:

(一)完全基因敲除策略

PNS载体仍然是胚胎干细胞基因打靶最常用的策略。在正选择标记基因的帮助下，通常将目的基因插入到功能最关键的外显子中，或者通过同源重组删除目的基因最重要的功能域，使目的基因被完全消除。

(B)大规模随机基因敲除-基因捕获

利用基因捕获建立随机插入突变的ES细胞库，可以节省大量筛选基因组文库和构建特异性靶向载体的工作和成本，更有效、快速地分析小鼠基因组的功能。另外，基因捕获法基因敲除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。

(3)精细变异的引入

人类的很多疾病都是因为基因功能的丧失，也有很多是因为基因过度表达或者功能获得。对于后者，用基因敲除的方法无法获得相应的疾病模型。为此，研究人员发明了各种方法来引入微妙的突变，如在小鼠基因组中插入终止密码子或替换氨基酸。

(1)打了就走策略，又称进退策略。

(2)双重置换法

(3)“标记和替换”方法

(4)通过Cre-LoxP系统引入点突变。

主要流程:

首先获得ES细胞系，通过同源重组技术获得研究者设计的突变的培养基靶ES细胞。

通过显微注射或胚胎融合将遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎。

经过基因修饰的ES细胞仍然保持着分化的全能性，可以发育成嵌合体动物的生殖细胞，使修饰后的遗传信息通过生殖系得以传递。

获得的具有特定修饰的突变动物为研究人员提供了一个特殊的研究系统，使他们能够研究活生物体中特定基因的功能。