如何定量分析蛋白质中化学修饰水平的变化

磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰，对完成或改变蛋白质的功能起着重要作用。这个领域有很多技术难点，对这个领域提出了挑战。近年来，相关技术取得了许多突破，磷酸化研究也取得了许多新成果。本文将介绍磷酸化蛋白质的检测，磷酸化蛋白质和肽的富集，生物质谱技术的改进，磷酸化蛋白质和肽的定量和比较。磷酸化蛋白质和磷酸化肽的生物质谱定量分析生命活动与蛋白质的动态变化密切相关。很多情况下，某些蛋白质的绝对量不会发生明显的变化，而是通过各种翻译后修饰来完成或修饰。

磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰，对完成或改变蛋白质的功能起着重要作用。这个领域有很多技术难点，对这个领域提出了挑战。近年来，相关技术取得了许多突破，磷酸化研究也取得了许多新成果。本文将介绍磷酸化蛋白质的检测，磷酸化蛋白质和肽的富集，生物质谱技术的改进，磷酸化蛋白质和肽的定量和比较。磷酸化蛋白质和磷酸化肽的生物质谱定量分析生命活动与蛋白质的动态变化密切相关。在很多情况下，某些蛋白质的绝对量不会发生明显的变化，但其功能会通过各种翻译后修饰来完成或改变。在蛋白质的大量翻译后修饰中，磷酸化是非常重要的一种，今天发现的所有蛋白质中超过30%可以被磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰与许多生物学过程密切相关，如DNA损伤修复[1]、转录调控[2]、信号转导[3]和凋亡调控[4]。对磷酸化蛋白质和肽的研究有助于我们阐明上述过程的机理，进一步理解生命活动的本质。近年来，许多相关的新技术和新方法不断涌现，推动了这一领域的研究进展。1磷酸化蛋白质的检测目前对蛋白质的研究大部分是基于电泳，凝胶上磷酸化蛋白质斑点的检测是一个重要环节。在早期的研究中，最常用的方法是将32P标记的磷酸盐代谢到细胞内并加以利用，使细胞内的磷酸化蛋白具有32P的放射性，电泳后即可检测到[5]。这种方法需要接触大量的放射性物质，并且只能应用于培养的细胞，所以已经逐渐被淘汰。抗磷酸化蛋白抗体的Western blot检测具有特异性好、分辨率高等优点，目前仍是一种常用方法[6]。但由于不能使用同一种凝胶进行分析和制备，有时检测到的蛋白点与凝胶上的很难对应，给分析带来困难。Schulenberg等人[7]在2003年报道了一种小分子荧光染料Pro-Q Diamond dye，可以特异性地对磷酸化蛋白进行染色。该方法方便、快速、灵敏度高，与质谱鉴定兼容，可用于其他染色方法。Martin等人[8]将一些蛋白质和多肽片段排列在几种商业基片上，然后用Pro-Q钻石染料检测芯片上蛋白质和多肽的磷酸化水平，灵敏度为365，438+02-625 fg。这种芯片和高灵敏度检测方法的结合为研究信号通路和磷酸酶抑制剂提供了一个强大的平台。荧光二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)是一种基于二维电泳比较荧光标记蛋白质差异的技术，具有非常好的检测灵敏度。而且由于待比较的目标蛋白质总是在相同的条件下进行单向和双向电泳，并展示在同一张胶上，减少了实验误差带来的差异，该技术成为比较蛋白质组研究的有力工具。磷酸化蛋白质只是某个蛋白质组中的一小部分，DIGE技术无法对其进行特异性标记，因此DIGE技术很难对磷酸化蛋白质进行比较分析。Seisuke等人[9]很好地解决了这个问题。他们在实验中利用磷酸化蛋白富集试剂盒富集磷酸化蛋白，然后利用DIGE技术分析差异，扩大了DIGE技术的应用范围。2磷酸化蛋白质和肽段的富集由于磷酸化肽段相对于非磷酸化肽段而言数量极少，在质谱鉴定中容易被其他肽段覆盖，因此往往需要对磷酸化蛋白质或肽段进行富集后才能进行鉴定。用于富集磷酸化蛋白质和肽的经典方法包括金属离子亲和层析(IMAC)[10]、生物素-亲和素富集[11]、免疫沉淀[12]和磷酸化抗体亲和层析[13]。上述方法大多基于色谱技术，色谱柱填料的性能是影响富集效果的关键因素。2004年，Pinkse等人[14]用TiO2 _ 2填料自制色谱柱，然后用此柱分离自磷酸化蛋白PKG的产物。在线ESI-MS/MS分析后，鉴定出PKG至少有8个磷酸化位点，还发现了两个新的磷酸化位点，Ser-26和Ser-44。Pinkse等人认为TiO2填料能高效、特异地与磷酸化肽结合，从而有效富集磷酸化肽，具有良好的应用前景。浓缩后用反相柱脱盐和质谱鉴定肽是一种常用的方法，但对于鉴定亲水性肽，如磷酸化后变成亲水性的磷酸化肽，效果不佳。Larsen等[15]比较了反相树脂和石墨填充柱对磷酸化肽的分离效果，认为后者能有效保留磷酸化肽，更适合磷酸化肽的富集、分离和鉴定。对于磷酸化肽的富集，一些学者已经不仅仅着眼于亲和填料的改进。Steven等人[16]发现，胰蛋白酶消化的肽段大多在pH2.7左右带两个正电荷，而一个肽段磷酸化后带一个正电荷。根据这一现象，带有一个正电荷的磷酸化肽段可以通过强阳离子交换色谱进行富集。Steven等人用这种方法在Hela细胞核的967个蛋白质中识别了2 002个磷酸化位点，获得了迄今为止最大的磷酸化蛋白质谱。3通过生物质谱确认磷酸化位点。磷酸化位点可以通过一级质谱结合串联质谱来确定。例如，MALDI-TOF/TOF初级质谱可以找到与肽分子量的理论值相差80 Da (HPO3=80 Da)的质谱峰。在该峰的二级质谱中，如果母离子为98 Da(中性损失H3PO4=98 Da)，则可以确定该肽为磷酸化肽(图1)，并进一步经过二级或多级质谱。另外，丝氨酸和苏氨酸的磷酸化残基通过β-消除反应转化为氨乙基丙氨酸，是赖氨酸的异构体。该位点可被胰蛋白酶、Lys-C内肽酶等酶特异性识别和消化，磷酸化位点可通过质谱轻易判断。因此，磷酸化位点的确认有赖于简化质谱和串联质谱的应用以及质谱检测灵敏度的提高。近年来，生物质谱技术的发展为蛋白质磷酸化位点的检测提供了更多可选的仪器和方法。3.1傅里叶变换回旋共振质谱(FT-ICRMS) T-ICRMS是目前为止最精确的质谱，分辨率为1~2 ppm或更好，这使得它适合于磷酸化位点的分析。离子捕获解离(ECD)是一种应用于傅里叶变换ICR质谱的技术，是对传统串联质谱的补充。二硫键可以很容易地打开，但在ECD断裂肽链时可以保留翻译后修饰的脆弱价键，这使得该方法适合翻译后修饰的研究。图1磷酸化肽A的鉴定:通过MALDI-TOF/TOF光谱的酶消化产物的一级质谱。磷酸化肽的质谱峰标有星号，相对于非磷酸化肽的理论分子量为80 Da (HPO3 = 80 Da)。b: a中用星号标记的质谱峰的二级质谱分析图中可以看到一个比母离子小98 Da (H3PO4 = 98 Da)的中性缺失峰。

specific/qwtz/show-133 . html