问一个关于重叠PCR的问题

1.我试图增加重叠区域的长度，但结果看起来不太好。80bp重叠区的扩增效果优于200bp重叠区。我觉得原因可能是重叠区域太长，可能会造成更多的非特异性退火。

2.通过改变热循环，可以起到一点作用。我的方法是50-60C放大10倍，延伸时间设为AC和BD；接下来，将退火温度直接升高到72C，通过两步法进行30次扩增，并将延伸时间设定为AD的延伸时间。虽然还是没有得到理想的结果，但是最多的碎片还是AC和BD，长的碎片非常非常弱。

3.正如Mybbff版主所说，我也试着调整了引物浓度。我看过韩健的专利技术TEM-PCR，其中的关键点是调整引物浓度实现片段富集。结合温度变化，把B和C的浓度降到很低，我做到了A和D，B和C相差50倍..我的想法是把BC的浓度调整到一个很低的水平，让它在对数扩增期之前耗尽，只允许TM非常高的引物延伸下一个72C。

4.目前我还没有得到理想的结果，长碎片的量也远不如AC和BD。我的想法是在设计引物和重叠区域的时候要多加注意。引物在TM值上一定差距很大，a，d >；b、C、A、D引物稍长。符合这些变化，然后调整程序，我相信会成功的。