酶切技术中的限制性内切酶

限制性内切酶可以特异性地结合到称为限制性酶识别序列的DNA序列中或附近的特定位点，切割双链DNA。可分为三类:ⅰ类和ⅲ类酶在同一蛋白质分子中既有切割又有修饰(甲基化)，并依赖于ATP的存在。I类酶与识别位点结合，随机切割离识别位点不远的DNA，而III类酶在识别位点切割DNA分子，然后从底物解离。ⅱ类由两种酶组成:一种是限制性内切酶，它切割特定的核苷酸序列；另一种是修饰相同识别序列的独立甲基化酶。ⅱ类限制性内切酶已广泛应用于分子克隆，是重组DNA的基础。大多数ⅱ类限制性内切酶识别长度为4到6个核苷酸的回文对称的特定核苷酸序列(如EcoRⅰI识别6个核苷酸序列:5’-G↓AATTC-3’)，少数酶识别更长的序列或简并序列。在识别序列中，ⅱ类酶的一些切割位点在对称轴处被切割，产生平端DNA片段(如SMAⅰ:5’-CCC GGG-3’)；有些切割位点在对称轴一侧，导致DNA片段带有单链突出端，称为粘端。例如，EcoRⅰⅰ切割识别序列并产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3 '

3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5 '

DNA纯度、缓冲液、温度条件、限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大多数限制酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量污染物进入限制性内切酶储存液时，会影响其进一步使用，所以每次吸收限制性内切酶时都要使用新的移液器头。如果使用两种限制性内切酶，需要注意提供各自的最适盐浓度。如果它们可以使用相同的缓冲液，它们可以同时被水解。如果需要不同的盐浓度，必须先用低盐浓度的限制性内切酶，然后调整盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶进行水解。或者，在第一次酶切反应完成后，用等体积的苯酚/氯仿萃取，加入0.1倍体积的3mol/LNaAc和2倍体积的无水乙醇，混合均匀，然后在-70℃冷藏30分钟，离心，干燥，重新溶解在缓冲液中，用于第二次酶切反应。