一步法PCR的特点及解释

◎逆转录和定量PCR可在一个反应管中一步完成，操作简单快捷；

◎采用化学修饰的热启动聚合酶，反应特异性高，有效避免非特异性扩增；

◎反应缓冲液经过充分优化，灵敏度高，最低可检测1pg总RNA中的目的片段，特别适合低拷贝RNA的检测。

◎加入百代生物RT-PCR的专利活素，可以明显提高RT-PCR的产量。CT值一般早3-5个周期，S形曲线较为典型。

描述:1，BIOGHSC？超级？探针混合物含有dNTP混合物和Mg2+，BIOGHSC？超级？酶混合物包含BIOG超级逆转录酶、BIOG热启动聚合酶和荧光素。2.一般来说，反应体系中引物的最终浓度为0.3μM，可以得到较好的扩增效果。当反应结果不理想时，可在0.1-1.0μ m范围内调整引物浓度..？3.TaqMan探针的最终浓度可以在0.1微米和0.45微米之间调节..4.qPCR灵敏度高，模板量的准确性对结果影响很大。建议适度稀释后加入模板，或用50？l反应系统。5.模板体积不应超过反应体积的10%。6.请选择100bp-500bp范围内的扩增产物长度，最好是100-200bp。？7、制备反应体系时，避免剧烈搅拌，以防产生气泡。8.反应条件:42℃逆转录反应15分钟，95℃加热5分钟激活热启动DNA聚合酶，然后95℃加热？15秒，60℃？35秒，35-40个周期。反应条件可以根据目标片段的大小和引物的Tm值适当调整。8.如果模板具有复杂的二级结构，反应温度可以提高到55℃，有助于提高产率。