流式细胞仪的应用范围
自20世纪70年代以来，随着流式细胞术技术水平的不断提高，其应用日益广泛。流式细胞术已广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床和基础医学研究领域。
肿瘤学中的应用
这是FCM在临床医学上最早的应用。首先需要将实体瘤组织解聚分散制备单细胞悬液，然后用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后分析细胞的DNA含量，将难以区分的组细胞分为三个亚组(G1期、S期和G2期)。DNA含量直接代表细胞的倍性状态，异倍体细胞与肿瘤的恶性程度有关。
(1)发现癌前病变，辅助肿瘤早期诊断:人体正常组织癌变需要一个从量变到质变的漫长过程，癌前细胞正处于从量变到癌细胞的转化阶段。人体正常体细胞具有相对稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生发展过程中可能伴有细胞DNA含量的异常变化。FCM能准确量化DNA含量的变化，作为诊断癌前病变向癌变发展的有价值标志，并能评估癌前病变的性质和发展趋势，有助于癌变的早期诊断。现已证实，癌前病变癌变的发生率与细胞的不典型增生程度密切相关。增生越严重，癌变发生率越高。随着非典型细胞增生的加重，DNA非整倍体的发生率增加，是癌变的重要标志。
(2)在肿瘤诊断、预后判断和治疗中的作用:FCM在肿瘤诊断中的重要作用已得到公认，DNA异倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力依据。FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大、灵敏度高等优点，已应用于日常工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对判断患者预后有重要作用。非整倍体肿瘤复发率高、转移率高、死亡率高，而二倍体和近二倍体肿瘤预后较好。
FCM不仅可以分析恶性肿瘤的DNA含量，还可以根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化来评价疗效，了解细胞动力学的变化，对肿瘤化疗具有重要意义。临床医生可以根据细胞周期各时相的分布和化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计出最佳的治疗方案，从DNA直方图中直接看到肿瘤细胞的杀伤变化，及时选择有效的药物，达到对肿瘤细胞的最大杀伤效果。
此外，近年来FCM已应用于细胞凋亡和多药耐药基因的研究[3，4]。医学工作者开始研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过测量细胞体积、光散射、DNA含量和特异性抗原基因(如bcl-2和Fas)分析细胞凋亡。多药耐药是肿瘤患者化疗失败的主要原因。多药耐药基因表达的测定(P170等。)，凋亡抑制基因和凋亡激活基因，为临床治疗效果分析提供有力依据。
在临床中的作用
FCM通过荧光抗原抗体检测技术进行细胞表面抗原分析、细胞分类和亚群分析。该技术在人体细胞免疫功能的评估以及各种血液疾病和肿瘤的诊断和治疗中发挥着重要作用。大量文章介绍了各种疾病中淋巴细胞亚群的变化。正常人群淋巴细胞的T4/T4/T8比值约为2∶1，但当人体细胞免疫功能低下时，该比值可能发生逆转。流式细胞术还可以监测肾移植术后患者的肾排斥反应。如果T4/T8比值颠倒，患者预后良好，肾排斥反应较少。反之，被拒绝的风险增加。同样，这种分析技术也用于诊断和治疗艾滋病。作者还报道了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值，并讨论了种族、性别、年龄等影响因素[5]。
目前FCM使用的单克隆抗体试剂有100多种，可以对各种血细胞和组织的表型进行测定和分析。
在血液病诊断和治疗中的应用
FCM通过检测和分析外周血细胞或骨髓细胞的表面抗原和DNA，在各种血液疾病的诊断、预后和治疗中发挥重要作用。
(1)白血病的诊断和治疗:FCM使用各种针对血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体，借助各种荧光染料(FITC、藻红蛋白PE等)测定一个细胞的各种参数。)来正确判断细胞的性质。各种血细胞系统都有自己独特的抗原。当形态学检查难以区分时，免疫表型参数在各种急性白血病的诊断和鉴别诊断中起决定性作用[6]。比如干细胞表达CD34，髓系细胞表达CD13和CD14，B细胞系表达CD10、CD19、CD20等。和T细胞系表达CD2、CD3、CD5和CD7。FCM可用于测定出血细胞表达的各种抗原水平，辅助临床诊断。
和其他肿瘤的治疗一样，DNA倍体的测定和细胞周期分析对白血病化疗有一定的指导作用。不同的白血病患者或同一患者在不同阶段白血病细胞增殖情况不同，因此定期了解细胞增殖情况，采取相应的药物，可以提高疗效。
目前除化疗外，造血干细胞移植也用于治疗急性白血病和一些疑难病症[7]。FCM可以通过对HLA配型的测定，为异基因造血干细胞移植患者选择最合适的供者。造血干细胞移植技术主要包括干细胞鉴定、活性测定、干细胞动员和收集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞纯化、干细胞回输、术后保持移植物抗宿主病低发病率等一系列过程。流式细胞仪测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞表面标志物已成为干细胞移植的重要监测工具。利用FCM检测一系列指标来观察患者的恢复状态，可以对预后做出早期判断。
(2)其他血液疾病的诊治监测:阵发性睡眠性血红蛋白尿症是造血干细胞的克隆性疾病，细胞内CD55、CD59抗原表达降低是该病的特征。这种抗原属于血细胞表面的磷脂酰肌醇锚蛋白家族，是一种重要的补体调节蛋白。可通过与补体C8、C9结合，阻止补体膜攻击复合物的形成，从而抑制细胞被补体激活溶解。FCM利用荧光单克隆抗体定量分析血细胞中CD59的表达，可以辅助临床诊断，判断疾病的严重程度[8]。
(3)网织红细胞的测定及临床应用:网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标。FCM结合一些荧光染料(吖啶橙、噻唑橙等)可以定量测定网织红细胞中的RNA。)，并得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。一些作者报道FCM方法比目测法更准确[9]。此外，FCM还可以测量网织红细胞的成熟度，对判断红细胞的增殖能力有重要意义[10]。为判断干细胞移植后的恢复情况、监测贫血的治疗、放化疗对肿瘤患者骨髓的抑制提供依据。
在血栓和出血性疾病中的应用
(1)血小板功能的测定:正常情况下，血小板以分散状态在血管中运行，但当血管受损、血流改变或受化学物质刺激时，血小板被激活，发生一系列变化。由于血小板活化的程度可以通过血小板膜糖蛋白的表达水平来判断，因此FCM测定血小板膜糖蛋白表达成为检查血小板功能的新手段[11]。该方法灵敏、特异。如果用全血法，只需要少量样本，适合儿童和血小板减少症患者[12]。当血小板被激活时，与静止状态相比，它们的质膜糖蛋白发生显著变化。FCM可通过单克隆抗体免疫荧光技术(血小板膜糖蛋白ⅱb/ⅲa、CD62、CD63等)监测血小板功能和活化。)，有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。
此外，当血小板被激活时，细胞内钙离子浓度变化很大。借助钙离子敏感的荧光探针，FCM可作为监测活化血小板的非免疫指标。(2)血小板相关抗体的测定:免疫性血小板减少性紫癜患者血浆中可产生血小板自身抗体，结合于血小板表面，称为血小板相关抗体。它们的分子可以是IgG、IgA或IgM。血小板标记有山羊抗人IgG、IgA和IgM荧光抗体，FCM可以测定血小板相关抗体的含量。直接法可以检测血小板表面的相关抗体，间接法可以检测血清中的相关抗体。该方法用于疾病的诊断和治疗监测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。
质量管理
一、流式细胞仪的校准
流式细胞仪的校准包括流路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色的补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性。仪器的校准主要使用标准微球进行监测。聚苯乙烯可以制成各种大小的微球，也可以进行荧光标记或具有定量免疫球蛋白的结合位点。具有固定荧光强度、尺寸和光散射的聚苯乙烯微球已经成为流动质量控制中的通用标准。
二、实验操作过程的质量控制
1，样品质量控制
用于流动分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检、组织活检、浆膜腔积液、脑脊液、皮肤、黏膜(内镜活检)、细针活检等。样品的条件控制可能是免疫表型分析质量控制中最困难的环节之一。每个样本对采集、储存、运输和制备都有不同的要求。一、观察样本外观:严重溶血、凝血或坏死的样本应丢弃。
其次，单细胞悬液的获取:外周血和骨髓穿刺液为天然单细胞悬液；机械分离和酶消化常用于活检组织。不同的实验要求应用不同的方法。对于膜抗原标记，不仅要获得足够的单细胞悬液，还要尽可能保证细胞结构的完整性和抗原性。机械方法更合适。如果只需要细胞周期或DNA倍性分析，在机械法的基础上增加酶消化(如胰蛋白酶和胃蛋白酶)更合适。
第三，抗凝剂的选择:外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果同一份血样用于白细胞计数和流量分析，则使用EDTA抗凝；对于血小板分析实验，肝素一般不用于抗凝。骨髓穿刺液中常用肝素或EDTA抗凝。因为相对大量的ACD会通过改变pH来影响骨髓细胞的活性，所以通常不推荐ACD作为骨髓穿刺液的抗凝剂。
四、样本的保存:理想情况下，样本采集后应立即进行处理和染色。肝素抗凝的血液和骨髓通常可以保存到48-72小时/室温(16-25)；EDTA抗凝外周血和骨髓可保存12-24小时/室温(16-25)；ACD抗凝外周血可保存72小时/室温(16-25)。对于仅在细胞中染色的样品，可以固定细胞以长期保存。然而，这种“固定-染色”方法取决于待分析抗原的特性和染色方法。
五、去除红细胞的方法:红细胞裂解法，操作简单快捷，最有可能保持原标本中白细胞的分布。染色后最好溶血。若染色前发生溶血，应确认:(1)抗原性未因溶血过程而改变；(2)溶血剂被完全洗去，细胞-抗体结合的动力学反应不受影响；(3)所用溶血剂不含固定剂，否则会影响细胞活性和表面标记结果。通过密度梯度离心，可以很好地回收靶细胞，并可能富集，同时去除红细胞和碎片，但耗时长，可能选择性丢失一些重要的细胞群体。
六、细胞与抗体的比例:厂家推荐的抗体剂量通常假设靶细胞数在5X105 ~1x106范围内。有些标本没有足够的细胞，而另一些标本由于细胞量大，在正常浓度下抗体相对过量或不足，导致假阳性或假阴性结果。因此，每个实验室应根据不同于制造商推荐的方法来调整细胞和抗体的剂量，以获得最佳的细胞/抗体比例。
第七，细胞活性的鉴定:死亡细胞对许多抗体具有很强的非特异性染色，这使得检测样本的细胞活性变得非常重要，尤其是那些经过长时间运输和保存的样本。通常有两种检测方法:(1)实时流动检测:死细胞用荧光染料碘化吡啶(PI)、7-氨基放线菌素D(7-AAD)或EMA(乙锭单酸)染色，活细胞拒绝这些染料染色。这种方法的优点是细胞表面标记和活性分析可以同时进行。尤其适用于高度坏死的样本。最常用的是7-AAD，因为它在488nm激发下最大发射光约为670nm，适合用FITC或PE做多色标记。但随着时间的推移，7AAD会在固定的细胞群体中重新分布，很难区分死细胞和活细胞。因此，对于固定后超过12小时染色和分析的标本，最好使用EMA。EMA与死细胞DNA稳定的价态结合，保证了长期固定后，可以很好的区分固定前的生死状态。(2)人工检测:使用台盼蓝或其他细胞活性染料。(3)使用专用仪器进行检测。例如Vi-cell。
2.选择和确定单克隆抗体的组合。
流动分析最基本的试剂是抗体。所选抗体的质量直接影响结果。影响抗体特性的因素有很多，如F/P比、亚型、全长或片段、种子来源、标记的荧光种类等。而且有CD分类号的单克隆抗体有300多种，还有大量没有CD分类号的单克隆抗体，使得抗体的选择更加困难。一般来说，选择抗体组合遵循以下基本原则:1)选择的抗体组合应足够广泛，能够识别样本中的所有细胞亚群，包括正常和异常群体。2)对于表达量少的抗原，应尽可能选择荧光强度强的荧光素标记。3)了解不同抗体的细胞反应谱和染色模式。根据不同的实验目的选择抗体。因为具有相同CD数的抗体可能识别不同的抗原决定簇。4)抗体的各种组合可能会影响抗原相互之间的结合(例如通过空间构型的阻碍)，所以对于所用的抗体组合，首先要知道每种抗体的单色标记在对照细胞上的表达。5)临床实验应尽可能选择体外诊断(IVD)试剂和分析特异性(ASR)试剂，而研究专用(RUO)试剂一般不能用于体外诊断实验。在中国，用于体外诊断的试剂也必须获得国内SDA认证。这样，一个抗体组合中的抗体可能来自不同的公司，浓度不同，亚型不同，F/P值不同，可能都需要自己的同型对照，但实际上这是很难的。然后，尽量选择同一家公司的试剂，减少上述干扰。对于临床常见的流量检测项目，所需的试剂组合基本上都有参考或推荐的抗体组合。
比如T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD 19/CD3；CD55和CD59通过阵发性血红蛋白尿症(PNH)检测；CD41，CD61等。但迄今为止，国际上还没有统一的白血病/淋巴瘤免疫分型的抗体组合。在2000年，国际细胞分析学会(ISAC)召开了一次由临床血细胞计数协会组织的国际专家会议，旨在就检测血液和淋巴肿瘤所需的最小和最有效数量的单克隆抗体达成* * *理解。75%的参与者认同抗慢性淋巴细胞增生性疾病(CLD)单克隆抗体有9种:CD5、CD19、κ、λ、CD3、CD20、CD23、CD10，CD45是初诊最基本的。淋巴瘤类似于CLD，至少需要12-16种单克隆抗体。对于急性白血病(AL)，75%的参与者认为大约13-15种单克隆抗体是最基本的:CD10、CD19、CD79A、CD13、CD33、CD34、CD45、Cd2和MPO。其他(CD16，CD56，CDW65，TDT，CYCD 3)可能对某些情况有用。几乎所有的投票者都认为完善急性白血病分类所需的单克隆抗体的合适数量平均为20-24个。但是这些抗体的组合也是一个大问题，目前没有统一的规定(见表2)。大多数发言人(11/13)指出，对于已经确诊的患者进行监测和分期，只需要几个单克隆抗体。
抗体的质量控制是实验的关键环节。抗体的质量包括特异性、敏感性和精确性。针对这些，一些商业公司推出了一系列质控品，用于常用单克隆抗体的检查。例如，贝克曼库尔特公司的Cyto-Trol和Immuno-Trol(见表1)。
3.染色方法
细胞表面染色:这种方法用于大多数免疫表型分析。但由于许多抗原也同时存在于细胞中，因此要特别注意保持细胞膜的完整性，以保证检测的特异性。表面标记可分为溶血前标记和溶血后标记。如果红细胞或血浆成分对标记有影响，适合溶血后标记，但要注意溶血剂膜抗原的影响，所以溶血剂一般不含固定剂。例如免疫球蛋白轻链检测和阵发性血红蛋白尿检测。
细胞内染色:某些细胞内抗原的检测对白血病的免疫分型尤为重要，如TDT、MPO、CCD 3、CCD 79 A等，细胞内染色的关键是使细胞膜通透，在不影响细胞骨架完整性的情况下，将抗体或核酸染料引入细胞内。还要保证固定化和膜渗透的步骤不影响相关抗原与相应抗体的结合力和核酸与染料的结合力。一些适合细胞内染色的试剂可能不适合表面标记分析。通常，细胞内染色不能与检测细胞活性同时进行，除非使用EMA法。对于细胞内染色，所用的荧光素应足够小，以穿透细胞膜。一些核酸染料(如、TO、AO等。)都是活细胞染料，不需要固定或透过膜。
细胞膜和细胞内染色:通常是细胞膜染色、固定、膜透性和细胞内染色，最后是DNA染色。
三。数据的获取和分析
流式细胞仪的数据采集必须建立在仪器性能校准的基础上。因为流式细胞仪是基于散射光信号和荧光信号的分析，所以仪器的散射光和荧光信号的光电倍增管的电压、增益、颜色补偿等参数的设置直接影响结果。同型控制的设置尤为重要。同型对照是指与单克隆抗体具有相同来源、亚型和标记荧光素的非免疫动物的免疫球蛋白。同时，浓度和F/P值应尽可能相同，这样阳性阈值的定义更准确，特别是对于弱表达抗原阳性率的确定。DNA倍性分析中参照物的设置非常重要，一般采用鸡红细胞作为内参照物。为了结果的可靠性，获得的细胞数至少应为10000-20000。但不同的实验目的一般对获得的细胞数量有不同的要求，如DNA倍性分析，至少要获得10000个细胞；微小残留病变(MRD)的检测需要达到10-4的水平，那么至少应该分析100000个细胞用于干细胞移植中CD34的检测，并且应该获得至少100个CD34阳性细胞或75000个有核细胞。
获得的数据应保存在listmode文件中，以便于分析。门控对于流数据分析非常重要。设置门其实就是确定分析区域。在DNA倍性分析中，门控实际上是将单个细胞圈起来，排除贴壁细胞。对于单细胞成分的标本(如培养细胞)，设置门相对简单。但对于成分复杂的标本(如骨髓)，要精确设置门就没那么简单了。在前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)的选通中存在许多干扰因素。目前越来越多的被免疫标记物和散射光的门控所取代。例如，CD45/SS门控已成为白血病/淋巴瘤免疫分型、CD34检测和MRD监测的最佳门控方法。CD19/SS门控非常适用于成熟B淋巴增生性疾病的分析。
在数据分析中，百分比、荧光强度、DNA指数(DI)和数量/ul是我们报告中常用的。百分比主要适用于侧重于细胞存在与否的检查指标的定量变化。如T细胞亚群检测、网织红细胞检测等。荧光强度主要用于检测细胞上抗原的量。如慢性淋巴细胞白血病(CLL)中血小板无力(GT)和CD20变化的检测。DI用于DNA倍性分析。外周血中CD4的绝对定量、OKT3治疗监测中的CD3、干细胞移植中的CD34等。在艾滋病分类中最终是以多少/ul浓度的形式表示的。对于白血病/淋巴瘤免疫表型结果的分析，以百分比的形式上报给临床，但单纯的百分比结果并不能完全反映肿瘤细胞的特征。因为20%的人工阳性判断标准忽略了20%以下的弱阳性结果，忽略了阳性结果之间荧光强度的差异，这些对于白血病/淋巴瘤的诊断和分型都是非常重要的。目前大多提倡用文字描述抗原存在和强度的报告方法，摒弃百分比的报告方法。
四、临床检验分析过程的质量评价
质量控制还必须重视检验方法的选择和评价。任何实验都必然有误差。从某种意义上说，误差可以分为实验方法论的系统误差和除此之外的随机误差。质量控制的方法和手段只能减少或消除随机误差，而不影响系统误差。为了将检验结果的误差控制在临床可接受的低水平或允许的误差范围内，需要使用检验方法(包括仪器、试剂、具体操作方法等。)符合临床要求，以确保检验结果在质量控制下符合临床要求。临床实验室质量控制的目的是在监测实验过程中出现重要错误时，用适当的方法警告分析人员。一般来说，检查实验结果质量的方法是确定质量控制材料。最常见的方法是对质控材料和患者进行常规检查。了解检验质量，就是把质控物测定的结果画在控制图上，观察控制结果是否超过控制限来决定是否失控。
在使用质控物的第一个月，检验人员每天随机将质控物插入患者标本中，确定检验项目。月末对当月的测量结果(n≥20)做简单统计，算出均值x和标准差s，如果检验结果的分布接近正态分布，可以用均值和标准差来描述检验结果的分布。这意味着95.5%的结果在x+2s的范围内，99.7%的结果在x+3s的范围内。为了观察质量控制结果，及时了解故障情况，经常使用质量控制图。
根据正态分布规律:1)所有测量值应均匀分布在均值两侧，不应有明显的不均匀感；2)质控品95.5%的测定值应在x 2s范围内；3)不应有连续6次以上落在平均值一侧的结果；4)连续5次以上的结果不能有逐渐增加或减少的趋势变化；5)不应有两个连续的结果在x 2s的范围之外；6)没有结果超出x 3s的范围。
如果不符合以上规律，结果就失控了。只有确认当天的质控结果处于受控状态，才能出具当天的临床检查结果。一旦失控，就要找出原因，重新检查。超过平均值±2个标准差范围的1测试结果将给出警告。同批实验中两个质控品的结果相差超过4s，也是失控规律之一，提示存在随机误差。同方向连续四次质控结果超出1标准差范围，也是失控规律之一，提示存在系统误差。
五、房间质量评价
进行内部质量控制，使实验的控制项目达到一定的精度。临床上往往只对实验结果是否可重复敏感。如果实验结果存在稳定的系统误差，临床和实验室一般不容易检测出来，所以内部质量控制在于控制结果的不精确。质控品由专门机构定期发放到临床实验室，检测后要求各单位返还检测结果。经过整理和统计，实验室和分析方法的差异以数据和报告的形式体现出来。根据各单位测试结果与目标值的离散程度，计算出本实验室的分数，并及时反馈给参与者，便于改进。这是室内质量评价的基本形式。室间质量评价主要是控制实验室工作的不准确性，是室内质量控制的补充。2000年，卫生部临床检验中心开始组织我国临床流式细胞仪间质评。目前已经进行了T细胞亚群的检测和CD34绝对计数的心室间质评估。