兽医体外诊断的发展趋势——分子诊断
宠物医疗服务，包括宠物的疾病诊断和日常保健服务，是宠物行业仅次于宠物食品的第二大子行业。根据疾病种类，宠物医疗服务包括宠物外科疾病、内科疾病、皮肤病、传染病和宠物免疫。传染病是由一些致病微生物引起的，如细菌和病毒，它们可以在一些动物或多种动物之间传播。养好宠物的关键是疾病的防治，尤其是一些传染性疾病，发病急，传播快，对动物的健康威胁很大。
随着人们生活质量的逐渐提高，狗和猫在人们的生活中扮演着越来越重要的角色。而且随着主人观念和宠物医疗质量的逐年提高，动物疾病诊断的准确率也从以前的“盲人摸象”逐渐走向了分子诊断的层面。
目前，分子诊断技术已广泛应用于感染性疾病(包括细菌感染、病毒感染、寄生虫、真菌、人和动物疾病等)。)，肿瘤等领域，因其具有灵敏度高、特异性强、简便快速、可定性定量检测等优点。分子诊断检验结果对临床医疗决策的贡献进一步增强，检验结果的重要性达到了前所未有的高度。
在宠物传染病检测技术方面，分子诊断核酸检测法也具有较高的灵敏度和特异性，可以最大程度地缩短传染病检测的窗口期。这种方法也是临床诊断人类感染性疾病的黄金方法。
其中，PCR是最常用的分子诊断方法。PCR技术利用一对寡核苷酸作为引物，通过变性-退火-延伸的循环来扩增目的DNA，具有高灵敏度和高特异性的优点。
实时荧光定量PCR实现了从定性到定量PCR的质的飞跃。实时荧光定量PCR技术(在PCR反应体系中加入荧光基团，借助荧光信号实时监测整个PCR过程)不仅具有传统PCR的优点，还具有特异性强、灵敏度高、重复性好、反应速度快、定量准确、自动化程度高等特点，已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。
实时荧光定量PCR可以早期准确诊断宠物疾病。
在目前的宠物临床工作中，普遍存在一个问题，就是很难或无法准确诊断某些病原体。具体表现在以下几个方面:
1，现有诊断技术灵敏度低。
如:病毒诊断常用的胶体金试纸。虽然胶体金试纸可以提供快速诊断，但这种方法是从蛋白质水平检测病原体，存在一定的交叉反应和动物自身抗体的干扰，导致临床应用中出现假阳性和假阴性结果；
2.疾病的早期诊断(如潜伏期)和对抗原要求高的疾病。
例如，使用传统的诊断技术(胶体金试纸和ELISA检测方法)不能提供准确的诊断依据。如犬瘟热、细小病毒；
3.临床上有很多病原体没有商业化，也不方便商业化生产试剂。
目前，这部分病原体(如猫传染性腹膜炎)的诊断还不能在兽医临床工作的医院中作出。如果需要做血涂片和大便检查，会导致主观性强，容易漏诊；
4、在疾病预防和控制过程中。
例如，疫苗接种是预防犬猫病毒性疾病的主要措施，但很难区分血清学检测的抗体是疫苗免疫产生的还是病毒感染产生的，而PCR可以准确检测病原体；
5.仍有一些病例很难诊断出微量的病原体。
细小巴贝斯虫等疾病。
因此，PCR(尤其是实时荧光定量PCR)使这些疾病的准确诊断成为现实。
根据农业部发布的2013全国动物疫病监测和流行病学调查计划的要求，结合我国现行的宠物疫病诊断国家标准，颁布了《犬细小病毒诊断技术》(GB/T27533-2011)和《犬瘟热诊断技术》(GB/T 27532-2065432)。
选择合适的PCR产物对于pet诊断尤为重要。
在临床工作中，可供兽医选择的PCR有很多，包括无核酸提取、等温扩增、液体试剂和冻干试剂、自动PCR等，让兽医无从选择。如何客观看待这些，做出科学的选择，接下来会详细阐述。
如果不提取核酸，假阴性的概率会增加。
核酸提取是分子诊断实验的“第一步”，是非常重要的环节，因为pet样本中的核酸必须先提取出来，才能进行后续的检测，可见核酸提取的重要性。核酸提取有两个主要目的:纯化(消除样品中的干扰物质)和浓缩(增加样品中核酸的浓度)。因为PCR检测的样本(血清、全血、细胞保存液、粪便等)中有很多干扰物和抑制物。)，核酸含量低，难以直接检测核酸，灵敏度差。因此，在检测之前，需要对样品中的核酸进行裂解、纯化和浓缩，即核酸提取。这是业内的主流做法。
比如临床上一些鼻咽拭子和口腔拭子的洗脱液就很简单，几乎是生理盐水+少量分泌物+大量游离病毒，不需要核酸提取就可以直接扩增。猫疱疹病毒FHV-1可以通过用棉签在鼻子和嘴里取样来检测。如果拭子的洗脱液是干净的，可以省略纯化步骤，但不浓缩，降低了检测的灵敏度。
此外，复杂的样品必须进行核酸提取。例如，猫冠状病毒(FCoV)大多在猫的腹水中检测到。腹水样本非常粘稠，含有大量蛋白质，无法直接检测。这个样本不经过提取直接放大，不是灵敏度下降的问题，而是检测不出来的问题。
等温扩增的缺点是成本高，很多产品需要专利保护。
等温扩增仪简单，检测时间快，检测灵敏度和PCR差不多。而等温扩增技术多为国外发明，目前仍处于专利保护期，应用并不普及，成本也相对较高。
真空冷冻干燥技术具有许多优点，是PCR试剂的发展趋势。
PCR的试剂成分包括纯化水、引物、聚合酶、Mg2+、dNTP和探针。这些成分混合后，在常温下会逐渐降解失效。所以液体PCR试剂需要分装到不同的小瓶中-20℃保存，使用时再解冻配制。因此，试剂的储存、运输和操作都很麻烦。
真空冷冻干燥技术可以完全升华试剂中的水分，而不破坏有效成分。冻干试剂可在室温下储存，无需冷链运输。使用时加水溶解，然后就可以像普通PCR试剂一样使用，所以是PCR试剂的趋势。
这里介绍一种全新的核酸扩增技术——苏州先达基因(gendx.cn)，以及具有完全自主知识产权的酶催化等温扩增技术(ERA技术)。通过基因工程，多酶系统，如重组酶、核酸外切酶、聚合酶等。，进行了改造，建立了专门的扩增反应体系。在30-42℃的恒温条件下，微量DNA/RNA的特定片段可在20分钟内扩增出来。该技术具有PCR扩增的特异性和LAMP技术的方便性，准确性高。
它具有可检测性、敏感性、快速性和特异性的优点。反应组分已混合并冻干成干粉，操作简单，易于保存。而且全程自产，相对价格更有优势。同时，配合其荧光恒温扩增仪，可以实现核酸的现场检测，不再受场地、时间、人员的限制。
分子诊断作为体外诊断技术的第四次革命，利用分子生物学方法检测患者(宠物)体内遗传物质结构或表达水平的变化，进而做出诊断，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后提供更准确的信息。与其他检测方法相比，具有无可比拟的优势。PCR作为分子诊断中最常用的检测方法，在宠物的临床诊断中将会越来越重要。同时，我们也相信我们首创的基因等温扩增核酸检测技术将以其检测速度快、价格低廉的优势在适时现场检测市场中脱颖而出。