DNA复制过程

简要说明了原核生物DNA的复制过程。

1.DNA双螺旋的解螺旋

在DNA复制过程中，双链DNA首先被解开形成复制叉，而复制叉的形成是一个复杂的复制过程，涉及多种蛋白质和酶。

(1)单链DNA结合蛋白(SSB DNA蛋白)。

SsbDNA蛋白是一种与单链DNA牢固结合的蛋白。原核生物ssbDNA蛋白在与DNA结合时表现出协同效应:如果第1个ssbDNA蛋白与DNA的结合容量为1，则第二个SSB DNA蛋白的结合容量可达103；真核细胞中的SsbDNA蛋白在与单链DNA结合时不表现出上述效应。ssbDNA蛋白的作用是保证解旋酶解卷的单链能保持其单链结构，直到复制完成。它以四聚体的形式存在于复制叉中，在单链复制后会被去除并回收。所以ssbDNA蛋白只是维持单链的存在，没有解旋作用。

(2)DNA解旋酶

DNA解链酶可以通过水解ATP解开双链DNA来获得能量。这种解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。如果双链DNA中存在单链末端或缺口，DNA解链酶可以先结合到这部分，然后逐渐向双链方向移动。在复制过程中，大多数DNA解旋酶可以沿着滞后模板的5’--> 3’方向移动，随着复制叉的进展，只有少数解旋酶(Rep蛋白)沿着3’--> 5’方向移动。因此推测Rep蛋白和特定的DNA解链酶在DNA的两条母链上合作解开双链DNA。

(3)DNA解链过程

Dna在复制前不仅是双螺旋而且是超螺旋状态，超螺旋状态的存在是解链前的必要结构状态。除了解链酶，还有一些特定的蛋白质，如大肠杆菌中的DNA蛋白质..一旦部分双链DNA解绑，必须有ssbDNA蛋白来稳定解绑的单链DNA，保证这部分不会回到双链。两条单链DNA复制的起始过程是不同的，但前导链和后续链都需要RNA引物来启动亚链DNA的合成。因此，前导链与后续链的区别在于，前者从复制起点继续合成5’-3’，不形成冈崎片段，而后者随着复制叉的出现，连续合成长度约2-3 KB的冈崎片段。

2.冈崎片段和半不连续复制

因为DNA的两条链是反平行的，复制叉附近解开的一条DNA是5’--> 3’方向，另一条是3’--> 5’方向，两个模板的极性不同。所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是5’--> 3’方向，而不是3’--> 5’方向，所以不能解释两条DNA同时复制的问题。为了解释两条DNA链的每个模板合成亚基的等速复制现象，日本学者冈崎等人提出了DNA的半不连续复制模型。在1968中，冈崎用3H脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取DNA，变性后，超速离心得到许多3H标记的DNA，称为冈崎片段。延长标记时间后，冈崎片段可以转化为成熟的DNA链，所以这些片段一定是复制过程中的中间产物。另一个实验也证明了在DNA复制的过程中，先合成了较小的片段，也就是测试了DNA连接酶的温度敏感突变体，在连接酶不起作用的温度下积累了大量的小DNA片段，说明在DNA复制的过程中至少有一条链先合成了较短的片段，然后连接酶链变成了大分子DNA。一般来说，原核生物的冈崎片段比真核生物的长。深入的研究也证明，前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物学中是普遍存在的，因此被称为DNA双螺旋的半不连续复制。

3.复制的启动和终止

所有的DNA复制都是从一个固定的起点开始的，DNA聚合酶只能延伸现有的DNA链，而不能从头合成DNA链。新DNA的复制是如何形成的？大量的实验研究证明，在DNA复制中，RNA聚合酶通常在DNA模板上合成一段RNA引物，然后聚合酶从RNA引物的3’端合成一条新的DNA链。对于主链，这个引发过程相对简单。只要有一段RNA引物，就可以从中合成DNA聚合酶。对于下面的链，起始过程比较复杂，需要多种蛋白质和酶。后续链的发起过程由发起者完成。引发剂由六种蛋白质组成，前引发剂或前体将这六种蛋白质结合在一起，并进一步与引发酶或引物加工酶组装形成引发剂。像火车头一样，起始子沿着链分叉的方向前进，间歇地触发模板上带有滞后链的短引物RNA链的生成，然后在DNA聚合酶III的作用下合成DNA，直到遇到下一个引物或冈崎片段。RNA引物被RNase H降解，缺口被DNA聚合酶I填补，然后每两个冈崎片段被DNA连接酶连接在一起，形成大分子DNA。

(4)端粒和端粒酶

1941年，印第安美国人人Mc Clintock提出了端粒假说，认为染色体末端一定存在一种特殊的结构——端粒。目前已知染色体端粒至少有两种功能:①保护染色体末端不受损伤，保持染色体稳定；②与核纤维层相连，使染色体得以定位。

在了解了DNA复制的过程后，科学家们质疑在20世纪70年代的DNA复制过程中，新链5 '端的RNA引物被移除后，缺口是如何填补的。不填的话，DNA每次复制都会变短。例如，当RNA引物被去除时，冈崎片段被DNA聚合酶I合成的DNA填充，然后它们被DNA连接酶连接成完整的链。而DNA聚合酶I催化DNA合成时，需要游离的3'-OH作为引物，最后剩下的子链的5 '无法填满，所以染色体短了一点。

在正常的体细胞中，一旦染色体酶被复制，端粒就会缩短是很常见的。据推测，端粒一旦缩短到一定的阈值长度，就会发出警报，指示细胞进入衰老；也许当细胞判断自己的染色体变得太短时，分裂就停止了，导致正常体细胞的寿命受到一定的限制。然而，在癌细胞中，染色体的端粒保持一定的长度。为什么？这是因为DNA复制后，染色体末端的短部分补充了端粒酶，一种含有RNA的酶，既解决了模板的问题，又解决了引物的问题。在生殖细胞和85%的癌细胞中检测到端粒酶活性，而在正常体细胞中未检测到。20世纪90年代中期，Blackburn首次在原生动物中克隆了端粒酶基因。

端粒酶在癌细胞中是活跃的，不仅能使癌细胞不断分裂增殖，还为癌变前的细胞或已经癌变的细胞积累额外的突变提供了时间，相当于增加了它们复制、侵袭并最终转移的能力。与此同时，人们开发了针对端粒的药物，即通过抑制癌细胞中的端粒酶活性来治疗癌症。

关于真核细胞DNA末端的结构特征，早在1978，Blackburn就以原生动物四膜浮现(纤毛虫的一种)为例:①锯齿形的发夹环；②仅由C和A重复组成的简单序列(C4 A2)20 ~ 70；③链条上有很多刻痕。