对基础实验的再认识(五)——PCR相关性
当时对PCR的影响一般，但操作上没有问题。但仔细想想，和其他实验一样，我的知识很少，PCR也是如此。所以我觉得有必要重新学习PCR相关的各种技术和原理。
进入正题
PCR(聚合酶链式反应)聚合酶链式反应又称体外DNA扩增技术，由美国塞特斯公司的Kary Mullis于1985年首创，可将少量DNA片段扩增一百万倍以上。Kary Mullis本人获得了1993诺贝尔化学奖。
前面分享过PCR的歌，在这里先回顾一下，再系统整理PCR的相关知识。
一、PCR的原理
在DNA聚合酶的催化下，以母DNA为模板，以特异性引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制与母模板DNA互补的子DNA的过程。
聚合酶链式反应用于扩增已知的短DNA片段，该片段可以是单个基因或只是基因的一部分。与生命体不同，PCR只能复制非常短的DNA片段，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，所以它的大小是用互补DNA双链的结构单位(核苷酸)来衡量的，单位是碱基对，bp)。
二、PCR反应组分
模板
太多:
非特异性条带增多。
太少:
PCR的产量下降。
底漆
预扩增核酸片段两端的已知序列决定了特异性。
高:
非特异性产物的扩增和错配增加了引物间引物二聚体的形成，产量下降。
低:
产量减少。
聚合酶
高耐热性
高:
引物非特异性产物的扩增。
低:
产品的数量减少。
dNTP
dATP、dGTP、dCTP、dTTP
太高:
加快反应速度也会增加碱基的错误掺入率和实验室检测的成本。
太低:
反应速度的降低可以提高实验的准确性。
缓冲器
镁离子
Taq酶是Mg2+依赖性的，这显著影响反应的特异性和扩增片段的产量。
超额:
会增加非特异性扩增并影响产量。
太低:
酶活性显著降低。
10~50毫米Tris- Cl (pH8.4)
维持Taq酶的碱性环境。
25~50毫米KCl
促进引物退火，> > 50 mM会抑制Taq酶活性。
100微克/毫升牛血清白蛋白(BSA)
它对酶有一定的保护作用，如果质量不好，会起到反作用。建议使用乙酰化BSA。明胶、吐温-20和二硫苏糖醇(DTT)具有类似的效果。
三、PCR反应的基本步骤
一般的聚合酶链式反应由20至35个循环组成，每个循环包括以下三个步骤:
变性:
退火或连接:
分机(分机):
4.PCR反应条件的优化
1，变性温度和时间:
保证模板DNA的熔化是保证整个PCR扩增成功的关键。
当在90 ~ 95℃加热30 ~ 60秒时，即使是最复杂的DNA分子也会变成单链。
过高的温度或持续时间过长的高温会破坏Taq酶活性和dNTP分子。
2.复性温度和时间:
PCR扩增的特异性取决于复性过程中引物和模板的组合。
复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。
需要根据底漆的Tm值来设定。
3.延伸温度和时间:
一般Taq酶的最适温度在70 ~ 75℃之间，当引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可将温度慢慢提高到70 ~ 75℃。
延伸反应时间可取决于待扩增片段的长度，小于1 KB和1 min就足够了。如果大于1kb，延长时间要延长。Taq酶可以按照1kb/min增加时间。
这里需要注意的是，如果延伸时间过长，可能会出现非特异性扩增。因此，有必要设定一个合适的延长时间。
4.循环次数:
在选择了其他参数之后，PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。
理论上20？25个循环后，PCR产物的积累可达到最大值。在实际操作中，每次反应的产率不可能达到100%，所以无论模板浓度是多少，20~30次循环都是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异性扩增越多。
动词 （verb的缩写）PCR延伸技术
从PCR延伸出来的技术有很多，这里只列举几个日常实验中常用的。
1 .触地PCR
登陆PCR主要用于优化PCR的条件。很多情况下，引物的设计给PCR带来困难，比如特异性不够，容易错配。如果退火温度太高，PCR效率会太低，但如果退火温度太低，非特异性扩增会太高。
因此，先前循环的初始退火温度被设定为比引物的最高熔化温度(Tm)高几度。在最初的几个循环中，温度逐渐下降到设定的最终Tm。在较高温度下获得高特异性匹配的模板后，在较低温度下高效扩增。
2.逆转录聚合酶链反应
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的原理是从组织或细胞中提取总mRNA，用逆转录酶用Oligo(dT)或随机引物将其逆转录成cDNA。然后使用cDNA作为模板进行PCR扩增，以获得目的基因或检测基因表达。
3 .实时PCR/定量PCR
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
4 .巢式PCR
首先，使用低特异性引物进行几个循环以增加模板的数量，然后使用高特异性引物进行扩增。
5.SOE PCR
重叠延伸PCR分为重叠延伸PCR定点突变和重叠延伸PCR序列缺失突变两种，即重叠延伸PCR基因拼接(SOE PCR)。
5.1重叠延伸PCR定点突变(因为原理简单，直接上图)。
这一步一定要用Pfu酶，不能用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物的末端加一个A，会造成产物的移码突变。
5.2通过重叠延伸PCR的序列缺失突变
6.高GC含量PCR
具有高GC含量(>:65%)，由于G和C碱基之间的强氢键，DNA模板难以扩增。富含GC的序列也包括二级结构。因此，富含GC的序列会导致DNA聚合酶沿着模板“堵塞”，干扰DNA合成。
为了扩增高GC含量的片段，必须解离双链模板，这样引物才能与模板结合，DNA聚合酶才能读取序列。为了克服强烈的GC相互作用，最常见的方法是使用PCR添加剂如DMSO或辅助溶剂来帮助DNA变性。但这些试剂通常会降低引物的Tm，因此需要相应调整退火温度。
高合成能力的DNA聚合酶由于与模板的结合能力更强，有利于完成高GC含量的PCR。超高热稳定性DNA聚合酶也有利于高GC含量的PCR，因为更高的变性温度(例如用98℃代替95℃)可能促进双链解离和PCR扩增。
7.AS-PCR
PCR(等位基因特异性PCR (AS-PCR)是指引物与模板的碱基错配可以有效抑制PCR反应，从而达到模板鉴别(等位基因鉴别)的目的。
因为在PCR中引物延伸从3’端开始，所以3’端的碱基对于引物延伸非常重要。如果这个碱基与模板互补，引物就可以连续延伸，PCR就可以正常进行，得到特定长度的扩增带，否则就无法延伸。因此，只要将不同于正常等位基因的突变碱基排列在引物3’的末端，当含有突变序列的引物用于PCR时，如果获得特异性条带，则表明被测基因含有该突变。没有出现特定的扩增带，说明没有这种突变。
注意:因为这里只使用了引物3’末端的碱基错配，所以需要找到合适的Tm才能达到检测目的。
参考
Mullis，Kary B .等人“扩增、检测和/或克隆核酸序列的方法”美国专利4，683，195。