基因编辑循环RNA |来源孔
随着高通量测序技术和生物信息学的发展，发现了上千种circRNA，围绕circRNA的基础研究也越来越多。大量研究表明，circRNA在哺乳动物细胞中是内源性的、丰富的、保守的、稳定的，并常表现出组织或时空特异性，可通过多种机制参与机体生长发育和疾病发生发展的调控。因此，近年来circRNA逐渐成为非编码RNA研究领域的热点。
根据circRNA序列的来源，可以分为三类:1。序列都来自外显子，称为外显子circRNAs？2.？序列来源于外显子和内含子，称为EIciRNAs？3.这些序列都来自内含子，称为ciRNAs。
CircRNA是由前mRNA的反向剪接形成的。目前，已报道的成环模型主要有三种:
？内含子反向互补序列驱动环化
外显子两端的侧翼内含子含有多对反向互补序列，促进内含子序列配对，使下游剪接供体靠近上游剪接受体，从而结合形成环状RNA。(图1。左)
？RNA结合蛋白驱动的环化
环化外显子两端的侧翼内含子包含RNA结合蛋白(RBPs)识别的基序。当RBPs与侧翼内含子的特定基序结合时，会形成二聚体，促使侧翼内含子相互靠近，然后连接成环。(图1。右)
？套索驱动环化
mRNA前体剪接时会发生外显子跳跃事件，产生包含外显子和内含子的套索中间体，然后中间体反向剪接形成环状RNA。(图二。)
circRNA最常见的功能是作为miRNA的海绵与miRNA结合，从而影响miRNA对基因的调控。例如Cdr1as，一种反义链转录的环状RNA分子，一种与小脑变性有关的蛋白基因，研究得很多，含有miR-7的约70个结合位点和miR-671的1个结合位点，其中与miR-7的结合方式不完全互补，只有结合，不会被AGO2蛋白降解。当Cdr1as高表达时，miR-7被结合，不能抑制原癌基因的mRNA，从而上调原癌基因的表达，导致癌变。当miR-671高表达时，Cdr1as降解，释放出miRNA，与原癌基因mRNA结合，发挥基因下调作用，抑制癌症的发生。(图三。)
许多环状RNA含有蛋白质结合位点，可用作蛋白质海绵。如RNA剪切因子Mbl可与亲本基因的第二外显子结合，促进其环化形成circ-Mbl，circ-Mbl可与Mbl结合，降低MBL的有效浓度，减少MBL产生。
circRNA除了作为miRNA和蛋白海绵，还可以作为支架蛋白，促进酶的定位，通过结合转录因子抑制目的基因的表达，参与调控亲本基因的表达，在一定情况下还可以翻译多肽。根据涉及的功能不同，circRNA的细胞定位也不同。例如，当它被用作miRNA或蛋白海绵时，circRNA需要从细胞核运输到细胞基质中才能发挥作用，而当它参与调控亲本基因表达或与转录因子结合抑制靶基因时，circRNA往往在细胞核中发挥作用。
(参考文献:克里斯滕森、L.S .、安德森、M.S .、斯塔格斯泰德、L.V .、埃贝森、K.K .、汉森、T.B .、&；Kjems，J. (2019)。环状RNA的生物发生、生物学和表征。？《自然评论遗传学》？20(11), 675-691.)
随着越来越多的内源性circRNA被发现在人体组织中广泛表达，circRNA与疾病的关系逐渐成为人们关注的焦点。目前研究最多的是circRNA与实体瘤的关系，以及一些促进肿瘤形成的circRNA，如头颈鳞癌中的CIRC PVT 1；Cirs-7(CDr1as)在结直肠癌、食管鳞状细胞癌和肝细胞癌中的表达。抑制肿瘤circRNA，如胶质母细胞瘤中的circsMARCA5和circ-SHPRH。还有一些circRNA可能在不同的组织或细胞中发挥不同的作用，如circHiPK3，它是直肠癌中的原癌基因，但在膀胱癌中抑制癌细胞。
除了癌症，研究还发现circRNA与糖尿病、心血管疾病、慢性炎症和神经系统疾病密切相关。相信随着生物技术的发展和对circRNA越来越深入的研究，circRNA的形成和机制可以更加清晰，也可以在疾病的预防、检测和治疗中发挥重要作用。
CircRNA敲除方案很难设计，一般采用以下两种方法:
方案一:在circRNA外显子两端设计两个gRNA，直接敲除环化外显子序列。虽然这个方案是完全敲除的，但是敲除circRNA的同时也会影响编码蛋白质的亲本基因，需要根据具体的实验目的来考虑是否可行。？
方案二:通过破坏circRNA形成环来实现敲除。需要先找到circRNA的成环元件，一般位于环化外显子两端的长侧翼内含子。成环元件找到后，两端设计gRNA进行敲除，不仅可以破坏编码基因的外显子，还可以敲除circRNA(图4。)
应用案例:
Circ-HIPK3是一种在人体细胞中大量存在的环状RNA。它可以与许多miRNA结合，并作为细胞生长的调节剂，影响肿瘤的形成。为了验证circ-HIPK3的成环机制，需要找到侧翼内含子中的成环元件，分别为上游和下游预测成环元件设计一对sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统敲除预测成环元件，检测circRNA的表达是否发生了变化。通过PCR和RT-QPCR发现，敲除下游成环元件后，circHIPK3的表达显著下调，而敲除上游成环元件后，circHIPK3的表达不下调，而是上调。推测可能是上游成环元素序列太多，预测不准确。为了进一步验证环化是由其他环化元件驱动的，分别用gRNA5或GRNA6 * *注射gRNA3或gRNA4，敲除环化元件上游的大内含子。RT-QPCR结果显示circHIPK3的表达确实下降，表明其他成环元件在上游起成环作用。
(参考文献:郑，秦，鲍，陈，郭，李，陈，...梁(2016)。环状RNA图谱揭示了一个丰富的环3，通过海绵多种miRNAs调节细胞生长。？自然通讯？7(1), 1-13.)
在研究circRNA功能的方法中，抑制circRNA最经典的方法是通过RNAi (shRNA)敲除circRNA。为了避免影响mRNA，设计方案中干扰序列应设计在反向剪接位点(BSS)。
通过设计高效shRNA，袁晶生物通过慢病毒法将干扰载体转入细胞中，按照最佳药物筛选浓度筛选细胞，直至对照组细胞全部死亡，从而获得circRNA敲除的稳定细胞株。
应用案例:
用siRNA敲除后，检测细胞增殖和凋亡，表明circ-HIPK3敲除抑制了细胞增殖。首先设计了三组实验，分别针对HIPK3 mRNA的线性转录本、circ-HIPK3的环状转录本和两个转录本* * *，siRNA设计在HEK-293？T细胞系上设计的siRNA只干扰相应的转录物。
用CCK-8和EdU细胞增殖和凋亡检测试剂盒检测细胞增殖和凋亡。结果显示，HIPK3 mRNA的敲低并不显著影响细胞增殖，而circ-HIPK3的敲低则显著抑制细胞增殖。
(参考文献:郑，秦，鲍，陈，郭，李，陈，...梁(2016)。环状RNA图谱揭示了一个丰富的环3，通过海绵多种miRNAs调节细胞生长。？自然通讯？7(1), 1-13.)
circRNA的过表达一直比较困难，比如成环效率低，容易错配成环。通过优化RBP的结合位点，如成环元件和QKI，circRNA可以准确有效地环化。过量表达后，仍需检测是否成功形成环，线性mRNA是否表达。为了研究新的环状RNA载体的表达系统的效率，选择小鼠环状基因4在各种细胞系(包括Hela、N2a、HEK293)中进行表达验证。根据RT-QPCR在不同细胞系中的实验数据，新的载体系统PCIRRNA-DMO-RTN4在几个不同细胞系中的效率远高于普通载体系统(PCIRRNA-Be-RTN4)。
Northern印迹是检测circRNA的金标准，探针通常跨反向剪接位点设计。但由于Northern印迹需要大量的circRNA，耗时耗力，且探针一般具有放射性，操作难度较大。常用的检测方案是RT-PCR或RT-QPCR，在反向剪接位点两端设计引物。(图9。)