乙醇回流提取黄酮类化合物的原理

在从植物转移到溶剂的过程中，主要影响因素是黄酮类化合物在所选溶剂中的溶解度。目前常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、丙酮等。其中，乙醇由于甲醇和丙酮的毒性，是提取总黄酮的常用溶剂，而且乙醇相对安全，易于回收。基于乙醇提取白三叶总黄酮的方法主要有回流法和超声波法。其中回流法是最常用的方法，提取效率最高。回流法是指用挥发性有机溶剂提取白车轴草的成分，将浸提液加热，蒸去溶剂后再浓缩回流到药材中，以此类推，直至有效成分提取完全。包括回流热浸法和回流冷浸法，其中热浸法溶剂量大，不能循环更新，而冷浸法溶剂量小，提取时可以循环更新，更适合白三叶总黄酮的提取。超声波提取黄酮类化合物是一种较新的方法。其原理是利用超声波在液体中的空化作用来加速植物药材中黄酮类化合物的提取，也利用机械振动、扩散、粉碎等次生效应来加速被提取物质的释放。该方法设备简单，操作方便，提取时间短。白三叶总黄酮提取率为55.5%。此外，还包括一种基于大孔吸附树脂的新型提取方法。在白车轴草总黄酮的提取方法中，有陈丹351等人发明的白车轴草地上部分总黄酮纯化方法专利和刘东风等人发明的基于超临界二氧化碳提取白车轴草总黄酮专利，为白车轴草总黄酮提取技术提供了新的方法学支持。

二、黄酮类化合物的测定

目前测定黄酮类化合物的方法很多，主要有分光光度法和色谱法。分光光度法是测定三叶草总黄酮含量最常用的方法，包括直接测定法和显色直接测定法，直接测定法在黄酮类化合物结构的特征吸收峰波长处测定含量，对于单组分样品的检测具有方便、快速、准确的优点。但对于复杂的中药成分，干扰因素较多，会影响测定结果，造成较大误差。另一种测定总黄酮含量的方法是碱性条件下的显色法。主要有两种显色方法。一种是NaNO2-A1(NO3)3-NaOH比色法，即在测定过程中依次加入NaNO2、A(NO3)3和NaOH的溶液，生成稳定的红色化合物，在(505±5)m处比色测定含量，这种方法是目前测定黄酮类化合物应用最广泛的方法，能有效排除多糖和皂甙。另一种是氯化铝显色法，即在测定溶液中加入氯化铝溶液，A1+与黄酮类化合物的3-或5-羟基和4-羰基或3 '，4-邻二酚羟基络合显色。413mm处最大吸收色谱技术已广泛应用于各种天然产物的定性定量分析，常用的色谱技术分为气相色谱。由于黄酮类化合物的高沸点和热不稳定性，有必要在气相色谱之前对样品进行衍生化。因此，高效液相色谱法被广泛应用于三叶草总黄酮的测定，也是目前公认的最佳方法。然而，高效液相色谱法存在价格高、分析时间长、分离效率低等缺点。