easy基因芯片测序技术简介
原理:甲醛处理的细胞将目的蛋白与DNA交联，交联的染色质被超声波断裂成小片段，一般在200-600bp范围内。然后利用抗原和抗体的特异性识别反应，沉淀出与目的蛋白结合的DNA片段。最后将纯化的DNA去交联，通过PCR和高通量测序进行扩增，最后与已有的基因组序列进行比对，确定DNA结合蛋白的序列。
问题分析:
1.甲醛交联对后续分析有什么影响？
从奥兰多五世等人最早发明芯片技术开始，十几年过去了，核心步骤并没有太大变化。但是ChIP-seq技术其实也有一些缺陷，比如甲醛交联。尽管甲醛是一种高渗透性的交联剂，但其交联效率低，因为其反应性仅限于胺。对于哺乳动物细胞，最大交联效率仅为1%。因此，甲醛交联细胞的初始量非常大，因此很难将该技术应用于微细胞和单细胞样品。牛津大学出版社出版的《体内甲醛交联:是时候进行黑盒分析了》一文指出，有些蛋白质，如阻遏蛋白、NF-κB等不能通过甲醛与DNA交联，研究表明；在DNA上停留时间少于5秒的蛋白质不能与甲醛交联。其次，甲醛会导致很多其他不相关的蛋白质交联到DNA上，影响后续的分析数据。有报道称，甲醛交联会引发DNA损伤反应机制，从而改变染色体组成，进而使芯片结果出现偏差。此外，由于在加热和低PH下交联反应会发生逆转，DNA卵与白质交联复合物的稳定性也是一个值得关注的问题。所以，甲醛能在多大程度上反映蛋白质在细胞中的分布，还不能确定。
芯片技术根据有无甲醛交联步骤分为两种。一类是甲醛交联的X-ChIP(交联和机械剪切切片)。另一种是没有交联的芯片，即N芯片(native-ChIP)；与X-ChIP相比，N-ChIP技术具有一系列优势，包括:分辨率高(MNase的使用可使染色体片段化至核小体大小)，避免了甲醛交联导致的非特异性蛋白在DNA上的富集，避免了甲醛交联对抗原表位的覆盖，减少了步骤数，减少了样品的损失。但由于使用了MNase，N-ChIP只适合研究组蛋白修饰，大多数情况下不能用于转录因子的研究。
2.超声波中断法和酶促裂解法的比较？
酵素:？最常用的酶如MNase，即微球菌核酸酶，是能降解核小体连接区DNA序列的核酸酶，最初分离自金黄色葡萄球菌。染色质的MNase消化可以释放独立的核小体。
MNase酶水解有一些局限性。首先，MNase倾向于切割A/T碱基位点，导致核小体在A/T富集区的表达低于真实情况。其次，MNase无法在核小体边界准确切割，导致确定染色质开放位置与真实情况存在差异；此外，MNase倾向于消化脆弱的核小体。不同物种中的实验证据表明，脆性核小体占据了基因的启动子和转录终止位点，并且脆性核小体只有在MNase浓度较低、消化时间较短的情况下才能被检测到，因此很难将脆性核小体定量到稳定核小体的相对丰度。
超声波中断不像酶切那样温和，而且由于中断的不均匀性，测序结果背景噪音高，影响后续数据分析。由于文章篇幅所限，这里就不赘述了。
所以是选择酶解还是超声波中断要看情况。可以参考以下建议:
如果所研究的蛋白质是高表达的，并且与DNA结合紧密，比如组蛋白，那么样品就不需要交联，然后可以用酶水解。
如果所研究的蛋白质的表达丰度较低或与DNA结合不紧密，如转录因子，往往需要用交联剂固定样品，以稳定蛋白质和DNA的形态。这时候最好用超声波的方法来破。
展开:
适用于微细胞水平的芯片技术及其原理
1)切割标记技术:
CUT-Tag可用于研究转录因子的结合位点和DNA的开放性。它可以在一天内完成从细胞到数据库的所有步骤，具有高分辨率、低噪音的特点。起始单元的数量可以低至50个。[1]
原理:利用抗原抗体特异性反应，加入特异性抗体与染色体上的目的蛋白结合，加入二抗与该抗体结合招募更多的pA-Tn5转座酶复合体到目的蛋白与DNA序列的结合位点，转座酶复合体切割染色质开放位点，在切割的DNA片段两端加入接头，文库构建完成，可直接测序。通过与现有的基因组序列进行比较，可以知道目的蛋白与DNA的结合位点。
2)冷却顺序:
Chil(染色质整合标记)，即染色质整合标记技术，可用于同时研究转录因子的结合位点和DNA的开放性。初始细胞剂量为100-1000个细胞。ChIL-seq避免了传统ChIP-seq技术中抗体沉淀导致回收率低的缺陷，特别适用于贴壁细胞。对于H3K4me3和H3K27ac等活性组蛋白标记物，初始细胞剂量甚至可以降低到单细胞水平。[2]
原理:将细胞加入到96孔板中，在固定和染色后，加入第一抗体以结合靶蛋白，然后加入ChIL探针(由第二抗体和ChIL DNA组成)。通过Tn5转座酶将探针中的ChIL DNA整合到靶蛋白的基因组DNA附近，然后通过ChIL DNA中的启动子启动T7 RNA聚合酶进行转录，以基因组DNA为模板合成RNA，用DNase I消化和切割该RNA以释放RNA，将纯化的RNA用于测序。
3.丢弃芯片:
滴片:采用特殊的微流控装置，分辨率可达单细胞水平。该技术不仅可以在单细胞水平上研究转录因子结合位点和组蛋白修饰，还可以从细胞特异性的角度研究不同细胞间染色质的变异程度。我们认为，单细胞染色质和单细胞表达数据的整合可以使调控元件和靶基因更精确地偶联，更深入地了解它们的功能动态和关系。[3]
原理:首先将待研究的细胞与裂解液和MNase混合进行染色质消化。此外，含有许多不同接头的液滴被设计成在微流体装置上反应，使得每个细胞液滴与接头液滴混合，并与含有DNA连接酶的缓冲液液滴混合。在这个过程中，接头序列自动连接到断裂的染色质片段两端，然后进行细胞裂解，利用特异性抗体沉淀目的蛋白，对富集的DNA进行测序。通过与现有的基因组序列进行比较，可以知道目标蛋白的作用位点。
[1].1:卡亚-奥库霍斯，吴SJ，科多莫CA，普莱克尔ES，布赖森TD，海涅科夫，艾哈迈德K，海涅科夫S . CUT & amp用于小样本和单细胞高效表观基因组分析的标签。国家共同体。2019 04 29；10(1):1930.
[2].Harada A，Maehara K，Handa T，Arimura Y，Nogami J，Hayashi-Takanaka Y，Shirahige K，Kurumizaka H，Kimura H，Ohkawa Y。染色质整合标记方法能够以较低的输入进行基因组分析。自然细胞生物学。2019年2月；21(2):287-296.
[3].罗滕，拉莫，肖雷什，斯珀林，戈兰，韦茨达，伯恩斯坦。单细胞芯片-序列揭示由染色质状态定义的细胞亚群。纳特生物技术公司。2065 438+05 nov；33(11):1165-72