分子生物学蛋白质磷酸化分析技术
身体活动、肌肉收缩、新陈代谢、肿瘤发生等。据统计，哺乳动物细胞中超过三分之一的蛋白质可以被磷酸化，蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质的研究更加复杂。真核细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸是
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的比例约为1800:200:1121。大多数磷酸化蛋白有多个磷酸化位点，它们的磷酸化位点是可变的。因此，一种蛋白质可能有多种磷酸化形式。虽然磷酸化蛋白质的蛋白质组学分析已经取得了很大的进展，但是仍然有许多困难需要解决，包括磷酸化蛋白质和皮肤片段的富集，可逆磷酸化位点的识别和磷酸化位点的定量。1磷酸化蛋白的识别
细胞中磷酸化蛋白的含量很少。质谱分析中，磷酸化的腹段信号往往被非磷酸化的皮段信号所抑制。因此，磷酸化蛋白质和皮肤片段的富集对提高磷酸化位点的检测具有非常重要的作用。
1的浓缩。1磷酸化蛋白
过去，与磷酸化蛋白富集相关的方法主要使用针对特定蛋白的抗体进行免疫沉淀。但是法律需要首先
蛋清了解，不适合大规模研究。虽然最近出现了针对磷酸化基团的抗体，但它们仅抗磷。
酸化酪氨酸的抗体效果更好[41。但抗体对磷酸化丝氨酸和苏氨酸的特异性不强。最近商业化了
磷酸化蛋白纯化富集试剂盒已在酵母中成功应用，但在其他组织中的应用尚未见报道。
1.2磷酸化蛋白胶染色
检测蛋清混合物中磷酸化蛋白质的经典方法是首先
通过电泳分离蛋白质，然后使用放射自显影或磷
通过免疫印迹检测酸化的蛋白质。最近亲Q Diaround
磷酸化蛋白胶染色是一项重要的技术突破。
。Break b]。这种特殊的荧光染料可以直接在胶水中检测出来。
对于磷酸化丝氨酸、苏糖酸和酪氨酸但不磷酸化的蛋白质
需要特殊的抗体或同位素标记。这种染色适合于
SDS-聚丙烯酰胺凝胶和二维聚丙烯酰胺凝胶。
这种染色与随后的质谱鉴定完全兼容。SYPRO
红宝石染色是对总蛋白的染色。穿过每一条游泳带或者
每个点的Pro-Q钻石染色和SYPRO红宝石染色。
可以了解磷酸化蛋白占总蛋白的比例。
两种蛋白染色结合可以降低高丰度蛋白的磷含量。
酸化状态不同于低丰度蛋白质的过度磷酸化状态。
2个磷酸化皮肤片段的富集
磷酸化位点的检测往往不是直接从蛋白质水平进行的。
测试，但是从皮肤层面。但是由于l。
现象的存在，在分析之前，应该先进行磷酸化皮肤段。
充实。
2.1固定金属亲和色谱
目前使用最广泛的方法是分离和富集磷酸化的腹部片段。
方法是固定金属亲和层析(fixed metal affinity)
色谱，IMAC).在这种方法中，键合是在螯合中进行的。
金属离子的选择(如Fe3。，气。、提示等。)在基板上。
在高pH值下，选择性地与磷酸化面上的磷酸基团结合。
、或磷酸盐缓冲液。洗提
脱盐后的溶液可直接用于质谱分析。
IMAC通常富含磷酸化的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
氨基酸残基。但这种方法的局限性是会丢熊。
去掉一些不绑定IMAC柱的低丰度磷酸化皮肤。
段；具有多磷酸化位点的皮肤因其亲和力强而非常吸引人
难以洗脱；一些酸性基团(如天冬氨酸和谷氨酰胺)
酸)、电子供体如组氨酸)也将结合到柱上。
非磷酸化皮肤的污染。因此，采用IMAC法富集磷酸。
去皮的效果很大程度上取决于所选择的金属离子。
填充柱的材料和洗脱程序。最近，菲卡罗
等待[C1]冷却皮肤的酸性残留物后再进行IMAC富集。
经过处理后，其特异性大大提高，有望大范围磷酸化。
该分析具有广阔的前景。
2.2磷酸化腹节的化学修饰
最近O da等人[1-1]把皮肤或蛋白质混合物放在碱性硫磺中。
在二乙醇溶液中，P2用于消除丝氨酸或丝氨酸的磷酸化
磷酸基团H3P0从苏氨酸上除去，形成的双键易受硫的影响。
二乙醇的替代，琉球对磷酸盐的替代。生物素与琉球
连接的、标记的皮肤或蛋白质，其上固定有抗生物素蛋白。
色谱柱，通过生物素和亲和素之间的高亲和力实现。
达到磷酸化皮肤或者蛋白质富集的目的。这种方法的主要
缺点是不能富集酪氨酸磷酸化蛋白和皮肤。
周等人I)通过另一种方法，使用二氧化碳修饰磷酸化。
亚胺浓缩反应:磷酸部分加入半铁硼酸，进行修饰。
皮片与碘酞酰胺树脂以价键结合，酸洗释放。
放上去。该方法可用于富集磷酸化酪氨酸和磷酸化酪氨酸。
设置磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸，但是需要很多步骤。
化学反应和柱纯化过程。