制备大豆蛋白抗氧化肽的详细步骤有哪些？
郑州同创益生食品有限公司提供的大豆分离蛋白；Novozyme提供的碱性蛋白酶(2.4AU/g)、风味复合酶(500LAPU/g)、复合酶(1.5 au/g)；广西南宁杰沃生物制品有限公司提供的木瓜蛋白酶(600，000 u/g)；广州丰田化工有限公司提供的菠萝蛋白酶(2500 gdu)；胃蛋白酶(1: 10000)，胰蛋白酶(250。U.F.U/mg)和亚油酸(分析纯),由适马提供；磷酸盐缓冲液(pH9.35)、FeCl2-EDTA溶液(0.05mol/L)、FeCl2溶液(0.1mol/L)、KSCN(40%)、乙醇(75%，含0.3mol/L HCl)、茚三酮显色剂、甘氨酸溶液(含氮量)
1.2仪器
紫外-可见分光光度计、超声波清洗机、离心分离机、pH酸度计、凯氏定氮仪、增压电动搅拌器、电动恒温水浴锅、恒温干燥箱。
1.3实验方法
1.3中氮含量的测定
凯氏定氮法(GB/T5009.5-2003)。
1.3.2大豆肽溶液的制备
配制4%(W/V)大豆蛋白溶液，快速加热至80℃，在80℃水浴中加热65438±00min，然后冷却至酶的最佳水解温度，保持温度和搅拌速度不变，用NaOH(HCl)标准溶液将溶液的pH值调节至酶解的最佳pH值。按比例称取蛋白酶，加入大豆蛋白溶液中，开始计时。反应过程中，及时加入NaOH(HCl)标准溶液保持pH恒定，在预定的反应时间抽取一定体积的溶液，然后迅速升温至85℃灭酶65，438±00min。冷却后，以5000转/分钟离心65438±00分钟，取其上清液测定水解度和抗氧化值。
1.3.3水解度的测定[4]
h =(A×10-3×10)/(14×0.1)= A/14(mmol/ml)
ho=4%×7.75=0.312(毫摩尔/毫升)
DH(%)=h/ho=23A (1)
注:H:大豆肽溶液中-NH2的浓度(mmol/ml)
Ho:蛋白质溶液中肽键的当量浓度(mmol/ml)
a:大豆肽溶液的氮浓度(微克/毫升)
1.3.4蛋白酶水解参数的测定
影响蛋白酶水解速率和蛋白质水解程度的主要参数是温度、pH值、底物浓度、酶浓度和时间。以水解度为指标，通过单因素试验确定参数的最佳值，再通过正交试验优化因素组合，从而确定蛋白酶的水解参数。
1.3.5大豆肽抗氧化值的测定[5]
参考文献[5]用于测定大豆肽的抗氧化值，并做了适当的修改:
将100 ml亚油酸原液、300ml 0.05mol/L的FeCl2-EDTA溶液和500ul大豆肽溶液放入小锥形瓶中，混合均匀，在50℃下避光保存4小时，然后取出1000ul，加入200u10.1mol/L的FeCl2。加入1000 ul 40% KSCN溶液，混匀，取出130ul置于干燥试管中，加入6ml乙醇(75%，含0.3mol/L HCl)，混匀，反应5分钟，然后在481nm处测量混合溶液的吸光值。以未水解大豆蛋白反应液的吸光值为空白值，其相对抗氧化值为1。
相对抗氧化值=未水解蛋白溶液的吸光值/大豆肽溶液的吸光值
2实验结果
2.1氮含量标准曲线
分光光度计(580nm)测得的不同浓度甘氨酸工作液的吸光度值见图1。
氮含量与吸收值之间的回归方程为:
y=1.3342x+0.0133 (2)，
回归系数为R2=0.998。
等式(2)的反函数是x=0.425y-0.0095(3)，
将等式(3)中X的值代入等式(1)中A的值。
DH(%)=0.17y (4).
2.2蛋白酶酶解参数的测定
以水解度为指标，通过单因素试验(限于篇幅，具体数据省略)确定参数范围，但通过正交试验优化因素组合。七种蛋白酶参数的最佳组合见表1。
表1七种蛋白酶水解参数的最佳组合
温度(℃) pH值底物浓度(%)酶浓度(%)时间(分钟)
碱性酶60 8.0 3 0.5 60
风味酶50 7.0 4 6 30
复合酶45 7.0 4 6 20
木瓜蛋白酶55 7.5 5 3 40
菠萝酶65 8.0 5 6 30
胃蛋白酶37 2.5 4 2 30
胰蛋白酶水解度50 7.0 5 3 302.3大豆肽溶液
2.3.1大豆肽溶液的吸光度值
用分光光度计(580nm)测得的不同蛋白酶水解的不同浓度大豆肽溶液的吸光度值见表2，未水解蛋白溶液的吸光度值为0.178。
2.3.2大豆肽溶液的水解度
将表2中的吸光度值代入式(4)得到相应的大豆肽溶液的水解度，结果如图2所示，其中未经蛋白酶水解的大豆蛋白溶液的水解度为3.03%。
从图2可以看出，7种蛋白酶对大豆蛋白的水解程度随着水解时间的延长(4小时以内)而增加，但水解速率开始变大，然后逐渐变小。其中，碱性蛋白酶的水解能力强于其他六种蛋白酶。
2.5大豆肽溶液的抗氧化值
亚油酸缓冲液和大豆肽混合溶液抗氧化实验后，用分光光度计在481nm处测吸光度，然后计算大豆肽溶液的相对过氧化值，用相对过氧化值表示大豆肽的抗氧化能力。结果如图3所示。
表2不同蛋白酶水解产物中大豆肽溶液的吸收值
光吸收值
1(1h)2(2h)3(3h)4(4h)
碱性酶0.605 0.705 0.975 0.985
风味酶0.545 0.632 0.877 0.909
复合酶0.487 0.532 0.587 0.627
木瓜蛋白酶0.340 0.349 0.355 0.412
菠萝酶0.422 0.474 0.708 0.808
胃蛋白酶0.231.243 0.293 0.299
胰酶0.462 0.583 0.599 0.603从图3中可以看出，蛋白酶水解大豆肽溶液的抗氧化能力随着酶解时间的延长(4小时内)先迅速增加，然后缓慢增加，有的甚至停止。在这7种酶中，碱性蛋白酶水解的大豆肽溶液抗氧化值最大。
3结论
(1)大豆肽具有抗氧化活性，不同蛋白酶制备的大豆肽抗氧化能力也不同。
(2)在所研究的7种蛋白酶中，碱性蛋白酶水解大豆肽的能力最强，抗氧化值最大，应该是最好的酶。参考
[1]陈H M，村本K.Y，田内F，等。从大豆蛋白消化物中发现的肽片段中提取的含组氨酸肽的抗氧化特性。食物。化学，1998，46:49-53。
张雪中。大豆肽加工技术的原理及应用。北京:科技文献出版社，1999: 181-200。
[3]陈美贞。大豆蛋白酶解物清除羟自由基的研究。食品科学，2002，23(1)；43-47.
[4]何，张迪庆。保健食品化学及其检测技术。北京:中国轻工业出版社。
[5]Adler-Nissen J .食品蛋白质的酶水解。爱思唯尔应用科学出版社。纽约，1986:74-78。
*项目支持:河南省重点科技攻关项目(0523011700)。
作者简介:黄季(1971 ~)，男，河南汝南人，博士，副研究员，研究方向为农产品深加工及功能食品开发。