聚合酶链反应简介
2英文参考聚合酶链反应[WS/T 203—2001输血医学常用术语]
PCR [WS/T 203—2001输血医学常用术语]
3聚合酶链式反应的定义聚合酶链式反应(PCR)是指用引物在体外选择性扩增DNA或RNA片段的检测方法[1]。该方法可用于输血领域的血型分型、骨髓移植配型、输血传播疾病的病原体检测等[1]。
聚合酶链反应(PCR)是一种体外酶促合成特定DNA片段的分子生物学实验方法，主要由高温变性、低温退火和适当温度延伸三个重复的热循环组成。即先将模板DNA在高温下变性成单链，用DNA聚合酶在适当的温度下使两条引物与两条模板DNA链上的互补序列退火，然后在DNA聚合酶的催化下，以四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)为底物延伸退火后的引物。重复地，两个已知序列之间的DNA片段以几何倍数扩增。[2]
4聚合酶链式反应的历史回顾4.1体外核酸扩增最早的设想是由科兰纳及其同事在1971中提出的:“经过DNA变性，用合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并持续关注这一过程，就可以克隆出tRNA基序”。但当时寡核苷酸引物的测序和合成比较困难，而当时(1970)Smith等人发现了DNA限制性内切酶，使得体外克隆基因成为可能，于是科兰纳等人早期的想法就被遗忘了。
4.2聚合酶链式反应的发明直到1985年，划时代的聚合酶链式反应(PCR)由美国PECetus公司人类遗传学实验室Mullis发明，使人们在体外无限扩增核酸片段的梦想得以实现。其原理类似于体内的DNA复制，但为试管内的体外DNA合成提供了合适的条件。首先，大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段被用于扩增人类基因组中的特定片段。因为酶不耐热，所以每次加热变性DNA后都要重新加入Klenow酶。当操作多个样本时，该过程耗时、费力并且容易出错。耐热DNA聚合酶的应用使PCR反应更容易自动化，随后PECetus公司推出了第一台PCR热循环仪，使这项技术的自动化成为现实。Mullis等人因为这项技术获得了1993年的诺贝尔奖。
聚合酶链式反应相关技术的发展PCR及相关技术的发展速度是惊人的。第一届和第二届PCR技术研讨会分别于1988年和1990年在美国和英国召开。第一场主要讨论PCR的应用和技术本身的优化；第二场会议的主要议题是人类基因组计划和PCR的最新进展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。
(表)聚合酶链式反应的相关技术
名字的主要目的是通过简并引物扩增来扩增未知的基因片段
巢式PCR提高了PCR的灵敏度和特异性，并分析突变。
多重PCR同时检测多种突变或病原体
通过反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，导致产物突变。
用单一特异性引物通过PCR扩增未知基因组DNA
通过已知序列用单侧引物PCR扩增未知cDNA
锚定PCR分析不同末端的序列
协同PCR减少引物二聚体，提高PCR特异性。
固定化PCR有利于产物的分离
膜结合PCR去除污染杂质或PCR产物残留
通过表达盒PCR产生合成的或突变的蛋白质DNA片段。
连接介导的PCR DNA甲基化分析，突变和克隆。
RACEPCR扩增cDNA末端
定量PCR定量mRNA或染色体基因。
原位PCR用于研究表达基因的细胞比例。
通过推定PCR鉴定细菌或遗传效应
通用引物PCR扩增相关基因或检测相关病原体
信使扩增表型作图和少量细胞mRNA的同步分析。
6随着其他扩增技术和PCR及相关技术的发展，新的扩增技术不断诞生。这些技术各有优缺点，与PCR互为补充，有些还可以结合应用。* * *同构已经成为体外核酸扩增技术的大家族。我们相信，随着分子生物学技术的发展，这个家族将会出现新的成员。
其他体外核酸扩增技术(table)技术利用转录依赖扩增系统(TAS)检测HIV连接酶链式反应(LCR)检测点突变和自主序列复制(3SR)系统研究RNA。临床应用，法医等链置换扩增(SDA)检测，基因鉴定Qβ复制酶系统增加探针检测灵敏度，循环探针反应增加探针检测灵敏度6.1。(一)连接酶链式反应(LCR)是一种新的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变研究和目的基因扩增。它是由拜克曼1997设计发明的，用于检测目标基因序列中的点突变，并获得专利。
LCR的基本原理是使用DNA连接酶。双链DNA片段特异性连接，通过变性退火连接三步反复循环，大量扩增目的基因序列。
LCR的扩增效率与PCR相似。用耐热连接酶做LCR只需两个温度循环，94℃min变性，65℃复性和连接，循环30次左右。其产品的检测也方便灵敏。目前，该方法主要用于点突变的研究和检测，微生物病原体的检测和定向突变等。还可用于单碱基遗传病的多态性和产物的诊断、微生物种类的鉴定、癌基因点突变的研究等。
6.2核酸序列依赖性扩增(a)基于核酸序列的扩增(NASBA)，也称为自持序列复制(3SR)或再生长序列复制技术。瓜特利等人在1990中首次报道了这项技术。
NASBA主要用于RNA扩增、检测和测序。
基本方法如下:扩增反应液中加入引物和标本，65℃1min破坏RNA分子二级结构，降温至37℃，加入逆转录酶、T7RNA聚合酶和RNase H，37℃反应1 ~ 1.5小时，琼脂糖电泳和溴化乙锭染色可见产物。
NASBA的特点是操作简单，不需要特殊仪器，没有温度循环。整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，保真性高，扩增效率比PCR高，特异性好。
6.3转录依赖性扩增系统(a)基于转录的扩增系统(TAS)由Kwen等在1989中报道，其主要用于扩增RNA。
TAS的主要特点是扩增效率高，因为它的RNA拷贝数呈10的指数增长，TAS只需6个循环靶序列，拷贝数就可以达到2×106。TAS的另一个特点是它的高度特异性。因为TAS只能经受六个温度循环，所以混溶率低，并且与葡聚糖珠的杂交也高。
该方法虽然具有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需要反复加入逆转录酶和T7RNA聚合酶，有待进一步研究。
6.4 Qβ复制酶反应(A)卡辛等于1972。首次报道Qβ复制酶催化RNA模板的自我复制功能，在室温下30min可将其天然模板MDV1RNA扩增至109。在1986中，Chu等人报道了具有生物标记的靶序列特异性探针可以与抗生物素蛋白连接的MDV1RNA杂交。在洗脱未结合的MDV1后，加入Qβ复制酶以扩增和复制MDV1的拷贝，然后通过溴化乙锭染色检测该拷贝或与相同来源的第二探针杂交。
Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，具有三个特点:①不需要寡核苷酸引物的指导就可以开始RNA合成。②能特异性识别RNA基因中分子内碱基配对形成的独特RNA折叠结构。③在Q β复制酶天然模板MDV1 RNA的未折叠结构区插入一个短的核酸序列，不影响酶的复制。因此，如果将核酸探针插入该区域，其序列可能被Qβ复制酶扩增。
Lizardi等，1988，用T7 RNA聚合酶从靶基因序列*** MDV1质粒转录MDV1 RNA探针。这种RNA探针可以与靶序列杂交，然后洗去未杂交的探针，加入Qβ复制酶对探针进行扩增，扩增后的探针可以作为模板进行指数级增加的扩增。用上述两种方法对产品进行检测。现在这项技术已经发展到夹心杂交、分子开关和靶依赖复制。
PCR技术的应用实例:研究:基因克隆；DNA测序；分析突变；基因重组和融合；蛋白质结合DNA序列的识别和调控；转座子插入位点的作图；基因修饰的检测；合成基因的构建；构建克隆或表达载体；基因核酸内切酶多态性的检测
诊断:细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分枝杆菌、立克次氏体、白喉、致病性大肠杆菌、志贺氏痢疾杆菌、嗜水气单胞菌、艰难梭菌等。);病毒(HTLV、艾滋病毒、HBV、HPV、EV、CMV、EBV、HSV、麻疹病毒、轮状病毒和细小病毒b 19)；寄生虫(疟疾等。);人类遗传病(莱什尼汉综合征、地中海贫血、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等。)
免疫学:HLA分部；T细胞受体或抗体多样性的定性分析；自身免疫性疾病基因定位；淋巴因子量化
人类基因组工程:通过传播重复序列产生DNA标记；构建遗传图谱(检测DNA、多态性或* * *作图)；物理图谱的构建；测序，表达谱
法医学:犯罪现场标本分析；赫拉迪克
肿瘤:胰腺癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液系统恶性肿瘤。
组织和群体生物学:遗传聚类研究；动物保护研究；生态；环境科学；实验遗产。
古生物学:考古学和博物馆标本分析
动物学:动物传染病的诊断等。
植物学:检测植物病原体等。
8 PCR的基本原理和概念8.1基本原理DNA在细胞中的复制是一个复杂的过程。参与复制的基本因素有:DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、启动酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、适当的pH以及解开超螺旋和双链DNA结构的一些酶和蛋白质因子。
PCR是试管中的DNA复制反应。其基本原理与体内相似。不同的是耐热Taq酶代替了DNA聚合酶，合成的DNA引物代替了RNA引物，通过改变温度如加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)可以复制DNA，反复的变性、退火、延伸循环可以使DNA无限扩增。PCR的具体过程如下:
当PCR反应体系加热到95℃左右时，双链DNA模板解绑成两条单链，这就是变性。然后，将温度降至引物的Km值以下，3’端和5’端的引物分别与两个单链DNA模板的互补区域结合。这个过程叫做退火。当反应体系温度升至70℃左右时，热稳定的Taq DNA聚合酶根据模板DNA核苷酸序列的互补方式，催化四种脱氧核苷酸依次加到引物的3’端，形成新的DNA链。每个循环都会使反应系统中的DNA分子数量翻倍。理论上几个周期后会增加到2 n倍。30次循环后，DNA产量达到2 30拷贝，约为10 9拷贝。PCR扩增过程如图81所示。实际上放大效率不到2倍，所以应该是(1+r) n，其中r是放大效率。
8.2参与PCR反应体系的因素及其作用参与PCR反应的因素主要有模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、反应温度和循环次数、PCR仪等。它们的功能介绍如下:
(1)模板核酸
用于PCR的模板核酸可以是DNA或RNA。当以RNA为模板时，首先进行逆转录生成cDNA，然后进行正常的PCR循环。核酸模板可广泛获得，并可从培养的细胞、细菌、病毒、组织、病理标本和考古标本中提取。
PCR反应中DNA模板的加入量一般为100100000拷贝。目前，可以从单个细胞制备相应的cDNA文库。适当含量的DNA模板可以减少多次循环PCR导致的碱基错配。
通常，模板DNA使用线性DNA分子。如果是环状质粒，最好先用酶切成线状分子，因为环状DNA复性太快。
(2)引物
引物决定了PCR扩增产物的特异性和长度。所以引物设计决定了PCR反应的成败。
PCR反应中有两种引物，即5’端引物和3’端引物。5’端引物是指与模板5’端序列相同的寡核苷酸，3’端引物是指与模板3’端互补的寡核苷酸。对引物的基本要求是:①引物长度过短会影响PCR的特异性，需要1630bp，因为4 164.29 x 10 9大于哺乳动物基因组3x10^9bp bp，保证了特异性结合；如果引物太长，延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74度)，也会影响产物的特异性。②G+C的含量一般为40% ~ 60%。③四个碱基应随机分布，连续相同的嘌呤或嘧啶不应超过三个。特别是在引物的3’端，不应该有三个连续的G或C，否则引物和核酸的G或C富集区会错误互补，影响PCR的特异性。④引物本身不能有互补序列，会引起自我折叠，至少引物本身的连续互补碱基不能大于3bp。⑤两条引物不能互补，尤其是它们的3’端。一对引物之间不超过4个连续的碱基应该是互补的，以避免引物二聚体。④引物与非特异性靶区的同源性不能超过70%或有8个连续的互补碱基，否则会导致非特异性扩增。①引物的3’端是开始延伸的点。所以，不应该有错配。由于ATCG导致的错配的规律性，引物3’末端A的影响最大，因此应尽可能避免引物3’末端的第一个碱基。引物的3’端不应是编码密码子的第三个碱基，以免因密码子3的简并性而影响扩增特异性。⑧可以对引物的5’端进行修饰，包括添加限制性位点、生物素、荧光物质和地高辛标记、引入突变位点、引入启动子序列、引入蛋白结合DNA序列等。引物的设计最好由计算机软件指导。
在反应体系中，一般要求引物浓度在0.10.5 μ mol之间。如果浓度太高，容易产生引物二聚体或非特异性产物。
引物的Tm值与退火温度有关，计算公式为Tm4(G+C)+2(A+T)。底漆的Tm值最好在5580℃范围内，最好接近72℃。
(3)热稳定的TaqDNA聚合酶
Chien在1976分离出耐热聚合酶，Erlich在1986分离纯化出适用于PCR的Tq耐热聚合酶，为PCR成为实用技术奠定了基础，并已通过基因重组生产出来。近来，可用于PCR的聚合酶有很多种:从水生嗜热菌中提取的Taq酶、从嗜热性嗜热幼苗中获得的Taq酶、从Litoralis嗜热球菌中分离的VENT酶和从酸-热浴硫化分裂幼苗中分离的Sac酶，其中Taq酶应用最广泛。Taq DNA聚合酶的分子量为94kD，75℃时的比活为150bs/酶分子。反应温度过高或过低都会影响其伸长，TaqDNA芽具有较高的热稳定性。实验表明，在92.5℃、95℃和97.5℃时，半衰期分别为40分钟、30分钟和5分钟。
纯化后的Taq酶在体外没有3’5’核酸外切酶活性，因此没有读数校正功能，可能会在扩增时造成错配。错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。通常Taq酶30次循环后的错配率约为0.25%，高于Klenow酶。Taq酶每周期移码突变率为1/30000，碱基置换率为1/8000。应用低浓度的dNTP(各20 μ mol/L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度和高于55℃的复性温度可以提高Taq酶的保真度，此时的平均错配率仅为5x10^6次/(核苷酸*周期)。
Taq酶具有与末端转移酶TdT相似的活性，可以在新生成的双链产物的3’端增加一个碱基，尤其是dATP。因此，将PCR产物克隆到载体上有两种方法:一种是构建dT载体；二是Klenow酶去除3’-末端A，即PCR反应后，99℃加热10min灭活Taq酶，调节Mg2+浓度至510mmol/L，加入12U Klenow片段，室温1520min去除3’-末端A。
Taq酶也具有逆转录活性。当Mg2+浓度为23mmol/L，温度为68℃时，出现类逆转录酶活性。如果有Mg2+存在，逆转录活性更好，这种活性可以直接用于RNAPCR，特别是用于短片段的扩增。
以前用Taq酶进行PCR扩增时，只能扩增出小于400bp的DNA片段。经过对Taq酶的结构和功能的改造以及PCR方法学的改进，可以扩增出20kb以上的DNA片段。
PCR反应中Taq酶的加入量也很重要。太少不好，太多浪费，导致非特异性扩增。通常每100μl反应液含12.5U Taq酶较好。最佳酶浓度确定在0.55U范围内，另一个问题是Taq酶虽然是热稳定性好的工具酶，但要在20℃保存。
(4)缓冲溶液
缓冲液为PCR反应提供合适的pH和一些离子，通常为1050 mmol/L..TrisHCI(pH8.38.8)缓冲液。含50mmol/L KCl的缓冲液有利于引物的退火。也有人加入小牛血清白蛋白(100μg/L)或明胶(0.0%)或吐温20 (0.05% 0.1%)或二硫苏糖醇(DDT，5mmol/L)，认为这些物质可以保护Taq酶。
(5)Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+。夏季Mg2+浓度过低时，Taq酶活性明显下降。Mg2+浓度过高，使酶催化非特异性扩增。Mg2+的浓度也影响引物的退火、模板和PCR产物的解链温度以及引物二聚体的产生。Taq酶的活性只与游离Mg2+浓度有关，但在PCR反应体系中，dNTP、引物和DNA模板中的所有磷酸基团都能与Mg2+结合，降低游离Mg2+浓度。因此，Mg2+的总量应该比dNTP的浓度高0.20.25mmol/L。如果反应体系含有螯合剂如EDTA，也可以结合一部分Mg2+。
为了获得Mg2+的最佳浓度，可以使用以下优化方法。首先，在PCR缓冲液中不加入Mg2+,从配置好的10 mmol/L的Mg2+储存液中向每个反应管中加入一定量的Mg2+,起初，浓度梯度增加0.5mmol/L (0.5，1.0，1.5，2.0，...5.0毫摩尔/升)。
(6) dNTP
DNTP是PCR反应的合成原料。每种dNTP的浓度应该是相等的，通常的浓度范围是20200 gmol/L，在这个范围内，PCR产物的量、反应的特异性和忠实性之间的平衡是最好的。例如，当每个dNTP为20μmol/L时，理论上可以产生2.6μg的400bp DNA。保持四dNTP的浓度高于其Km值(1015μmol/L)可以保持碱基掺入的保真度。如果dNTP的浓度大于50摩尔/升，Taq酶的活性会受到抑制。
(7)反应温度和循环时间
1.变性温度和时间
变性步骤在PCR反应中非常重要。如果模板DNA和PCR产物不能完全变性，PCR反应就不能成功。DNA分子中G+C含量越多，需要的变性温度就越高。过高的变性温度和时间会影响Taq酶的活性。通常的变性温度和时间分别为95℃和30s，有时使用97℃和15s。虽然DNA链在变性温度下分离只需要几秒钟，但反应管内部达到所需温度需要一段时间，因此需要适当延长时间。为了保证模板DNA能够完全变性，最好是710min，然后在以后的循环中变性的步数设置为95℃/min。
扩增100300bp的短片段时，可采用快速两步PCR法，即变性(9497℃)、退火和延伸(5575℃)。
为了防止反应溶液在变性温度下蒸发，可以在反应管中加入65438±02滴液体石蜡。
2.复性温度和时间
复性温度决定了PCR的特异性，适宜的复性温度应低于引物Tm值的5℃。退火温度过低，造成非特异性扩增；提高退火温度可以提高扩增的特异性，因此应严格控制退火温度。退火反应时间一般为65438±0分钟。
在PCR的第一个循环开始时，反应在远低于Tm值的温度下开始。由于Taq酶在低温下仍有活性，此时有可能在引物与模板的非特异性界面出现非特异性产物或引物二聚体，然后非特异性产物在整个PCR反应中反复扩增，导致PCR严重失败。为了尽可能的消除这种非特异性扩增，可以采用热启动的方法，热启动的方法有几种:一种方法是在PCR体系中加入抗Taq酶抗体。抗体和Taq酶的结合抑制了Taq酶的活性。所以刚开始的时候，虽然温度低，引物可以和模板错配，但是因为Taq酶是无活性的，所以不会引起非特异性扩增；当进行热变性时，抗体在高温下失活，释放出Taq酶，在后续的延伸步骤中可以发挥作用和表征。
异质DNA聚合。另一种热启动方法是用石蜡将Taq酶从PCR反应体系中分离出来，这样一开始在室温下没有非特异性扩增。当温度升高到热变性温度时，石蜡融化，Taq酶与PCR阴性体系混合，从而在后续步骤中发挥作用。使用热启动可以提高PCR扩增的特异性。
3.延伸温度和时间
一般延伸温度在72℃左右。此时Taq酶活性为每秒35100个核苷酸，1分钟足够一个2kb的片段。如果DNA片段较长，扩增时间可以适当延长。延长延伸时间会导致非特异性扩增。
4.循环次数
循环次数主要取决于初始目标分子的浓度。例如，当初始目标分子为3x10^5、1.5x10 4、1x10 3和50个拷贝时，循环数可以分别为2530、3035和3540。太多的循环会增加非特异性产物的数量和碱基错配的数量。在PCR反应后期，扩增产物的增加并不是成指数增长，这就是所谓的平台效应。平台效应可能与以下因素有关:dNTP和引物浓度降低，酶与模板的比例相对降低，多次循环后酶活降低，产物浓度升高后变性不完全，影响引物延伸。
(8) PCR仪
进口和国产的PCR仪很多。仪器的加热和冷却方式可以是气体加热、水加热和电加热块加热。温度、循环次数和时间等参数现在都由计算机控制。可以根据需要选择仪器。
因为PCR法灵敏度高，少量的靶分子就可以扩增到无限多。因此，今后要防止PCR扩增产物污染环境，造成假阳性PCR。因此，PCR仪和PCR产物检测的过程应尽可能与标本制备和PCR反应管制备分开，最好在不同的房间。通常，实验空间可分为样品处理区、反应混合制备和PCR扩增区、产物分析区等。
9聚合酶链式反应检查聚合酶链式反应是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为体外基因扩增。PCR技术类似于DNA的自然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
9.1聚合酶链反应正常值体内细菌的种类和比例正常，人体处于动态平衡和健康状态。
9.2聚合酶链反应的临床意义聚合酶链反应可以快速、特异地扩增任何已知的目的基因或DNA片段，可以很容易地在pg水平启动DNA混合物中目的基因的扩增，达到纳克、微克、毫克的特定DNA片段。因此，PCR技术一问世就迅速广泛应用于分子生物学的各个领域。
异常结果:各种疾病引起的异常，如梅毒。①一期梅毒。即硬下疳，潜伏期2 ~ 4周，外生殖器出现暗红色硬块、浅表溃疡、软骨样硬度、淋巴结肿大。②二期梅毒。一期梅毒1 ~ 2个月后，全身皮肤、黏膜出现对称的泛发性皮疹、斑疹、丘疹、脓疱等。可出现黏膜斑块和扁平疣，传染性强。③三期梅毒。发生于感染后2 ~ 3年甚至10年，皮肤呈胶状肿胀，也可累及骨骼、关节、心脏、血管。主要表现为动脉炎、主动脉瓣关闭不全和主动脉瘤等。，而侵犯的神经有脊柱结核、全身瘫痪(麻痹性痴呆)等。