微生物如何获得所需的ATP？

荧光快速检测:生物传感器的应用不是梦——访中科马良生物工程有限公司技术总监金贞花教授

ATP荧光法是根据萤火虫发光原理发展起来的一种快速检测技术。萤火虫发光是因为它们可以合成将化学物质的化学能转化为光能的生物催化剂，如萤火虫荧光素酶(简称荧光素酶)、D-荧光素和ATP(三磷酸腺苷，一种所有细胞生物都能产生的能量物质)。在有氧条件下，荧光素酶催化荧光素产生氧化荧光素，并发出荧光。如果满足以上条件，即使是萤火虫以外的系统也能发出荧光。早在20世纪50年代末，美国国家航空航天局就利用萤火虫荧光素酶建立了快速超微ATP检测技术。20世纪60年代末，检测出地球土壤样本中的ATP，并应用于未来探测月球和火星上是否存在生命。基于昆虫荧光素酶的ATP检测的商业应用始于20世纪80年代末，最初是通过培养萤火虫幼虫来获得荧光素酶。随着基因工程技术的发展和应用，科学家从萤火虫细胞中提取出编码萤火虫酶的基因，并将其导入细菌细胞。这样通过生物发酵，短短十几个小时就可以获得大量的昆虫荧光素酶。

2003年，中科马良引进了中科院发展所金贞花教授发明的“含荧光素酶基因的新菌株及昆虫荧光素酶的生产”专利项目。经过几年的产业化探索，终于在2005年后开始批量生产具有自主知识产权的昆虫荧光素酶和昆虫荧光素酶制剂，并于2007年完成相关检测产品的配套，实现了食品样品中细菌总数的快速检测。基于昆虫荧光素酶的ATP荧光检测原理只有当ATP存在时，昆虫荧光素酶才能催化昆虫荧光素酶的反应并产生荧光。因此，如果荧光素酶和荧光素酶太多，荧光强度将只取决于反应体系中ATP的量。以检测样本中的细菌为例，细胞越多，ATP越多，荧光越强。也就是说，在一定条件下，荧光值与ATP的量成线性关系；此外，荧光值可以通过光度计容易且精确地测量。因此，在排除样品中非细菌ATP干扰的情况下，只要得到相对荧光值与细菌细胞数的关系曲线，然后根据纯ATP的相对荧光值与细菌细胞数的标准曲线就可以快速确定样品中的细菌细胞数。

ATP快速检测系统的组成和功能目前，基于萤火虫发光原理，用于生物量、酶和代谢物检测的应用系统有很多。虽然各种检测系统的应用目的、操作方法和样品来源不同，但在组成上都包括以下几个部分。

1.试剂系统试剂系统包括促进荧光反应所需的所有试剂和有效的ATP提取试剂。具体包括体细胞裂解试剂组、细菌细胞裂解试剂组和荧光反应试剂组。体细胞裂解试剂组可以特异有效地裂解样品中的非细菌细胞(体细胞)并释放出ATP，然后通过比色杯底部的滤膜将其去除。细菌细胞裂解试剂组的主要作用是有效裂解细菌细胞，释放ATP进行检测。同时，为了避免ATP降解，影响检测结果的真实性，细菌细胞裂解试剂应能快速使ATP降解酶失活。荧光试剂组包括荧光素和能与样品中细菌ATP相互作用并发出荧光的荧光素。

2.采样器和样品预处理装置这部分包括可以定量获取不同物理状态下待测样品的采样器、对体细胞排出的ATP进行加压的加压器、反应用带膜比色皿、样品浓缩用杯架和专用浓缩器等。

3.显微光度计显微光度计，即微型荧光检测仪器。根据具体需要，光度计除了具有用于测量和显示荧光值的屏幕之外，还具有与个人计算机或自动打印机结合的外部接口，以便记录和存储用于产品质量或卫生监测趋势分析的相关数据。

ATP快速检测技术的优势一般来说，实现快速检测依赖于待测样品在反应过程中能够产生易于检测的声、光、磁等信号。通过产生易于检测的荧光来实现ATP荧光的快速检测。在健康监测方面，具有常规检测无法比拟的优势。实践和文献资料都表明，利用快速检测系统检测到的荧光值，即总ATP值(来自细菌和食物残渣的ATP)作为健康监测指标，无论是“时效性”还是实际效果，都要比目测或细菌平板计数好得多。因此，有人认为ATP总量可以作为判断健康状况好坏的标准。

1.采用快速准确的常规平板计数法检测细菌总数，即使细菌在LB培养基上生长成肉眼可见的菌落。由于样品稀释不均匀，一个菌落往往由两个或两个以上的细菌细胞组成，LB培养基只适合需氧或半需氧细菌的生长。所以只能得到这类细菌的数量。ATP荧光快速检测法可检测所有细菌、真菌、藻类，1-5分钟即可得到实时检测结果，操作简单，时间短。平板计数法耗时1-5天，结果难以反映实际卫生情况。

2.样本量小。由于荧光素酶对ATP非常敏感，通过发光反应可以检测到0.1皮克分子(10-12摩尔)以下的ATP，因此可以用于检测细菌含量较低的样品。比如0.45um膜过滤灭菌的啤酒中细菌含量很低，用常规方法检测不出来，而用ATP荧光浓度可以检测出来。ATP快速检测技术的应用“ATP荧光快速检测系统”自20世纪90年代开始用于全程监测。根据萤火虫发光原理研发成功并投放市场的产品有很多。如中科马良研发的ATP荧光快速检测系统，可用于食品、饮料、乳制品的全过程监控:在生产加工前，可用于检测生产设施的清洗消毒效果和原料中的细菌总数；在加工生产过程中，可用于生产设备关键控制点(如供水、通风阀门)的卫生学监测，影响乳品发酵饮料、酒类中特殊微生物总数的检测；经加工生产后，可用于检测成品中的污染菌总数。此外，还可用于环保、水政、海关、检疫等执法部门对各种样品中微生物(细菌总数)的快速检测。ATP快速检测在HACCP中的应用通过对食品生产线或周边卫生环境的研究发现，如果用平板计数法得到的生产线上某一点的细菌总数很少或无菌，而用ATP荧光检测法得到的ATP值很高，那么该检测点后期容易滋生大量微生物。经过分析，认为ATP荧光检测得到的总ATP值来自残留物和微生物。并且在大多数情况下，来自微生物的比例很小。所以可以通过ATP荧光检测的ATP值来判断检测点是否会再次被污染，而不是根据细菌细胞的ATP值换算的细菌菌落总数，但关键是要确定不同生产线不同检测点的ATP临界值。基于此，发达国家已经在HACCP中使用ATP荧光检测来评价食品原料和清洗消毒后的食品原料接触表面是否符合卫生标准。然后重点监控容易造成微生物污染的关键部位。比如通过ATP的快速检测，可以判断从常规消毒到新生产的间歇时间内是否存在污染的可能；然后，制定出既符合本单位情况，又符合卫生要求的ATP数值范围。袖珍式ATP快速检测仪的应用目前袖珍式ATP快速检测仪已经应用于生活的方方面面，在食品方面的应用主要是检测餐厅和火车上的餐具卫生状况。中国铁道部决定，在2008年奥运会前，在列车上使用沈阳中科马良生物工程有限公司的便携式快速检测仪，替代间接氯离子检测法进行餐具卫生检验。此外，基于荧光素酶的ATP快速检测还可应用于其他领域和用途，如自来水检测、桶装水无菌检测、军事野战饮食中的炭疽检测、环境监测、临床检测等。