判断细胞生死的方法

活细胞和死细胞的识别在生物学和医学上具有重要意义。为了在细胞培养过程中随时记录细胞的生长情况，需要经常测量细胞的存活率。在肿瘤细胞的研究中，为了测试各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，还需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中，活细胞和死细胞的识别也有很大的应用。例如，为了检测男性的生育能力，常用的方法是测定精子细胞的活力。

鉴别死细胞和活细胞的方法有很多，包括染色和仪器分析。染色是鉴定细胞生死的常用方法，简单易操作。但通过直接的形态学观察来判断细胞是活的还是死的，实验结果容易受到操作者主观因素的影响，存在一定的误差。因此，在实际操作中经常使用一些仪器进行准确的批量检测。

不同的死细胞鉴别方法有不同的具体反应机理，但无论采用哪种方法，都是利用了死细胞生理功能和性质的差异。

常用的方法包括染色和仪器分析:

1染色法

染色方法可分为化学染色法和荧光染色法。根据不同的染色机理，染料既可以染死细胞，也可以染活细胞。活细胞和死细胞在生理功能和性质上的差异主要包括:

活细胞和死细胞细胞膜通透性的区别:活细胞的细胞膜是选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性通过；细胞死亡后，细胞膜受损，通透性增加。台盼蓝区分细胞生死的常用方法就是利用这一性质。台湾看起来是蓝色的。也被称为台盼蓝，是一种阴离子染料，不能穿透完整的细胞膜。所以台盼蓝染色后，只有死细胞能被染色，活细胞则不能。甲基蓝也有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也能识别生死。

活细胞和死细胞的代谢差异:是亚甲蓝染料鉴别酵母细胞的依据。亚甲蓝是一种无毒染料，其氧化形式为蓝色，还原形式为无色。由于在活细胞中进行代谢，细胞具有很强的还原能力，可以将亚甲基蓝由蓝色氧化变为无色还原，所以染有亚甲基蓝的活酵母细胞是无色的。而死细胞或代谢缓慢的老细胞，由于其非还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝处于氧化状态，从而被染成蓝色或浅蓝色。

荧光素二乙酸酯(FDA)是一种常用的染料，用于鉴定培养的动物和植物细胞的原生质体的活力。它的染色机理也是利用了活细胞和死细胞的代谢差异:FDA本身不产生荧光，而且是非极性的，可以自由地穿入和穿出完整的细胞膜。当FDA进入活细胞后，在细胞内被脂肪酶分解产生一种能产生荧光的极性物质——荧光素，它不能自由穿透活细胞膜，在细胞膜内积聚，从而使活细胞产生绿色荧光；然而，不活跃的细胞不能产生荧光，因为它们不能分解FDA。

此外，还有一些细胞器的特殊染料。如液泡系统的特殊染料中性红。中性红是一种低毒染料，能使活细胞的液泡变红，但细胞质和细胞核不着色。死亡细胞的液泡不着色或淡染，染料分散在整个细胞内，细胞核和细胞质被染成红色。有时为了增加染色效果，可以将两种染料混合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。

2仪器分析方法

微电极技术(利用活细胞膜和死细胞膜两面的电位差)、自动细胞计数器、流式细胞仪可以批量准确检测细胞的生死。

德国INNOVATIS公司生产的全自动CEDEX细胞存活率/细胞计数器/细胞分析仪是世界上第一台高分辨率、高清扫描(专利)细胞分析仪，具有自动台盼蓝染色、显微CCD成像和Cedex工作站软件，可用于制药、医疗、发酵、免疫、病理、毒性检测、生物技术等学科的研发和工业生产中的细胞计数与分析。自动分析结果，检测分析数据输出(11项):细胞总数，细胞总浓度(细胞/ml)；活细胞的数量和浓度(细胞/毫升)；死亡细胞的数量和浓度(细胞/毫升)；细胞存活率(%)；细胞的平均圆度；平均细胞直径(μm)；聚集率；细胞直径直方图；聚集直方图；细胞圆度直方图；细胞生长时间图。

流式细胞仪常用的判断细胞生死的荧光探针有两种:一种是能穿透活细胞膜发出荧光的物质。比如FDA可以被活细胞持有，发出黄绿色荧光。如果细胞受损，它将从细胞中消失，并且不能观察到荧光。另一类不能穿透活细胞膜，但能对固定细胞和膜受损细胞的细胞核进行染色。例如，碘化丙锭(PI)和溴化乙锭(EB)通常用作第二类荧光探针。碘化丙锭(PI)不能穿透细胞膜，不能对细胞膜完整的正常细胞或凋亡细胞进行染色。对于坏死细胞，细胞膜的完整性丧失，碘化丙锭(PI)可以对坏死细胞进行染色。目前常用的细胞凋亡和坏死检测试剂盒含有Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)。发生凋亡时，染色质会收缩，Hoechst 33342能穿透细胞膜，染色后凋亡细胞的荧光会明显增强。两种染料双重染色后，正常细胞呈弱红色荧光+弱蓝色荧光，凋亡细胞呈弱红色荧光+强蓝色荧光，坏死细胞呈强红色荧光+强蓝色荧光。