现代生物学和农业技术在药用植物研究和生产中的应用是怎样的？
1902年，第一个做植物组织培养实验的G.Haberlandt预言高等植物的离体细胞可以长成植株。这一假说成为日后植物组织培养的理论基础。
1937年，White建立了组织培养的综合培养基，并与Gautheret等人一起，首次成功地利用烟草的茎形成层细胞和小块胡萝卜根在人工培养条件下增殖和诱导愈伤组织。他们建立的植物组织培养的基本方法，成为以后各种植物组织培养的技术基础。
在1948中，F.Skoog和崔培发现，在培养烟草茎和髓的培养基中加入适当比例的腺嘌呤和生长素，可以控制植物组织长出幼苗或根，也就是说，当腺嘌呤和生长素的比例高时，就会产生芽，当比例低时，就会形成根。后来C.D.Miller等人(1956)发现用激动素代替腺嘌呤效果更好，建立了激动素与生长素比例控制器官分化的激素模型。激素“控制论”的这一理论至今仍在植物组织培养研究中起着指导作用。
20世纪50年代，组织培养技术迅速发展，从静态固体培养发展到液体培养，包括悬浮培养、微室培养、保育培养和平板培养。在1958中，Steward等人利用液体悬浮培养将胡萝卜体细胞通过胚状体发育培养成完整植株，并开花结实。这一突破不仅证实了Haberlandt的“细胞全能性”思想，也为研究组织培养中的器官形成和胚胎发生开辟了新的领域。
20世纪60年代初，E.C.Cocking等人成功地用真菌纤维素酶分离了植物原生质体，为原生质体融合技术和体细胞杂交等基因工程的迅速发展创造了条件。
近二十年来，由于培养的植物细胞在一定条件下具有全能性，组织培养技术在生产中的应用得到了重视和发展，并逐渐成为农业、林业、园艺、医学等方面的重要研究手段，促进了形态学、细胞学、生理学、生物化学、遗传学和育种学等一系列学科的进步。
随着分子生物学和生物工程的发展，植物组织培养技术日趋完善。20世纪60年代以后，植物组织培养开始应用于生产，使植物生产走向工业化应用时期。花卉和草药，通过无性繁殖系快速繁殖植物，工厂生产的试管品种的商业化；通过大量细胞培养技术生产药物的方法已经在日本、联邦德国和其他国家获得成功。总之，植物组织和细胞培养是一门潜力巨大的新生物技术，它将以崭新的面貌进入世界新工业革命的行列，展现出光明的前景。
目前植物组织和细胞培养技术在植物学等学科的实际应用主要在两个方面:(1)植物育种和快速繁殖；(2)生理活性物质的产生。
一、植物组织培养的实验设备、灭菌方法和基本培养基
(1)植物组织培养实验设备
1.实验室的设置
(1)无菌操作间配有接种用净化工作台、放置接种工具和培养物的工作台、安装在天花板或墙壁上用于灭菌的紫外线灯管。最好有通风装置过滤细菌。
(2)培养基制备室
配制各种培养基，室内必须有大面积的平整工作台和放置各种化学药品和器皿的柜架。储存配制好的培养基母液的冰箱，制备和储存蒸馏水的设备。
(3)恒温培养室
培养室需要空调控制恒温和照明装置。一般培养箱的温度保持在25℃左右，温差不要超过65438±0℃。
培养室必须有培养架、摇床、旋转台等培养装置和设备。
(4)细胞学实验室
放置各种显微镜和解剖镜以观察培养结果。在条件允许的情况下，可以建立摄影设备，拍摄实验结果。
(5)化学实验室
准备各种常规和先进的化学分析测定仪器设备，进行各种化学分析测定。
2.仪器和器具
(1)玻璃器皿
用碱溶解度低的硬质玻璃制作的器械、器皿，特别是长期培养，如果选用非优质玻璃制品，容易产生不良影响。
常用的玻璃器皿有:三角烧瓶、乳头烧瓶、T型管、角形烧瓶、圆形烧瓶、L型试管、平行角形试管、圆扁形烧瓶、皮氏培养皿、玻璃环、载玻片、盖玻片、漏斗、分装器、注射器、圆底烧瓶、分液漏斗、玻璃板、玻璃柱、冷凝器、萃取器、染色。
(2)器具和仪器
选择医疗器械和微生物实验室使用的仪器，如刀、剪刀、镊子、解剖刀、接种针等。
(3)仪器设备
一般需要天平、酸度计、离心机、显微镜、解剖镜、恒温箱、烘箱、冰箱、摇床、旋转床、旋转培养架、分光光度计、薄层扫描仪、高压液相色谱仪等。
(2)植物组织培养的灭菌方法
1.容器和培养基的灭菌
培养皿、工作服、口罩、帽子等。可高温消毒，一般用1.2大气压20-30分钟；培养基消毒时间不能太长，否则有些物质容易分解破坏，1.2个大气压，15分钟就够了。金属器械的消毒一般在使用前用70%的乙醇浸泡，然后在火焰上点燃消毒冷却后再使用。
2.植物材料的灭菌
植物材料的灭菌主要是外部灭菌，应根据材料对消毒剂的敏感性选择消毒剂的种类和浓度以及处理时间的长短。首先将实验材料在肥皂粉溶液中仔细刷洗并用流水冲洗，然后按照表13-1和13-2所列的方法和顺序进行灭菌。
表13-1常用灭菌器效果对比
表13-2植物不同器官的灭菌顺序(三)植物组织培养的基本培养基
1.培养基成分
植物组织培养基通常由下列物质组成(表13-3):
表13-3几种常用培养基的成分(单位:毫克/升)
(1)无机养分
无机养分包括大量元素和微量元素。除了碳(C)、氢(H)和氧(O)之外，大量的元素是氮(N)。通常使用硝态氮或铵态氮作为氮素，但在培养中经常使用硝态氮，硝态氮和铵态氮也混合使用。磷酸盐常用于磷，硫酸盐常用于硫。钾是主要的阳离子，钙(Ca)、钠(Na)、镁(Mg)的需要量较少。常量元素的比例通常按照培养全株的Knop溶液的配方进行修改。一般来说，营养培养基应含有至少25毫摩尔的硝酸盐和25毫摩尔的钾。当铵的含量超过8mmol时，对培养物往往是有毒的。但是对于常规的愈伤组织培养和细胞悬浮培养，硝酸盐+铵的浓度可以增加到60mmol。钙、硫和镁的浓度在1-3毫摩尔的范围内。所需的氯化钠由钙盐、磷酸盐或微量营养素提供。微量元素包括碘(I)、硼(b)、锰(Mn)、锌(Zn)、钼(Mo)、铜(Cu)、钴(Co)和铁(Fe)，其中碘可能是不必要的。
(2)碳源和能源
大多数植物细胞需要2-4%的蔗糖，在一些植物组织培养中，蔗糖的浓度高达7%甚至15%。糖源在培养基中可能具有除碳源和能源以外的其他功能。蔗糖也可以用葡萄糖和果糖代替，其他糖类不太理想。肌醇可能不是必需的，但在一般培养基中大量使用，可能与其促进愈伤组织生长的作用有关。
(3)维生素
在各种维生素中，盐酸硫胺素(B1)可能是必需的，而烟酸和盐酸吡哆醇(B6)只能促进生长。
(4)生长调节物质
植物激素是培养基中不可缺少的成分，对植物愈伤组织的诱导、培养物的生长、器官的分化和次生产物的代谢有直接的影响。培养基中通常添加两种激素:一种是生长素，常用的有2，4-D、NAA、IAA、IBA等。另一类是细胞分裂素，常用的有激动素(Kt)、玉米素(Zt)和6-苄基嘌呤(6-BA)。2，4-D的适宜浓度为10-7—10-5mol，IAA的适宜浓度为10—10—10-5mol，最高浓度为1—10 mg/L，NAA的适宜浓度范围高于前两者。正常情况下，只有2，4-D (10-5—10-7mol)才能成功诱导出愈伤组织。如果生长素如2，4-D与细胞分裂素结合使用，效果会更好。当诱导外植体分化植物时，使用萘乙酸结合细胞分裂素可能更好。在细胞分裂素中，激动素和6-苄基嘌呤都有广泛的应用，能促进愈伤组织的生长，适宜的浓度为10-7-10-6 mol。
(5)氨基酸
培养基应该包括某些氨基酸，如甘氨酸。此外，水解酪蛋白常用于组织培养，它是多种氨基酸的混合物。特别是在分化培养基中添加一定量的水解酪蛋白可以促进胚胎发生和多胚现象。有些氨基酸是某些次生物质的前体(如苯丙氨酸和鸟氨酸，是东莨菪碱生物碱生物合成的前体)。将它们添加到培养基中，组织培养中这类次生物质的含量和产量将明显增加。
(6)有机添加剂
培养基中添加一些天然产物，有利于愈伤组织的诱导和维持，也有利于促进生长和次生物质的形成和积累。其中最常用的是椰奶、酵母精、番茄汁、豆粉。其浓度范围:椰奶10%(体积/体积)，酵母抽提物0.5%，番茄汁5-10%，豆粉0.1-0.5%。这些天然添加剂在培养基的制备中倾向于选择完全已知的合成化合物，因为它们的成分复杂且难以确保一致性。
2.培养基的制备
(1)水和药品
最好使用在玻璃容器中从脱矿质盐蒸馏出的蒸馏水来制备培养基。使用的化学品应该是纯净的。生长调节剂优选在使用前重结晶。蛋白水解物最好用酶水解，这样氨基酸在自然状态下能更好的保存下来。
(2)母液(原液)
配制培养基的一种简便方法是先配制一系列母液。大量矿物盐(大量元素)可以配制成比所用浓度厚10倍。溶解矿物盐时，尽量将Ca2+与SO2-4-和PO3-4错开，避免形成硫酸钙和磷酸钙的不溶物。最好用一定量的蒸馏水溶解矿物盐，然后依次加入，最后加水至一定体积。微量元素可制成使用浓度100-1000倍的浓缩液，与大量元素一起存放在冰箱中。每种维生素可以单独配制，保存在容量瓶中，浓度为0.2-1 mg/L，铁盐需要单独配制(见前文)。植物激素在配制时有不同的要求。称取NAA、2，4-D、IAA等生长素类物质，用少量95%乙醇溶解，再用蒸馏水稀释至一定浓度；细胞分裂素要用少量的0.5或1N盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量；叶酸应溶于少量稀氨水中，然后加入蒸馏水至所需量；生物素配制时可直接溶于水。
(3)高压灭菌和保存
配制培养基时，取出各种母液，按所需体积混合在一起，临时加入蔗糖、激素等附加成分，与事先加热融化的琼脂混合(液体培养不加琼脂)，然后用氢氧化钠溶液或1N盐酸调节pH值至所需的某一值(5.5-5.8之间)，再分别装入培养容器中。将配制好的培养基在高压灭菌器中于120℃和1.1kg/cm2下灭菌15-20min。灭菌后的培养基可在室温下保存(最适温度为65438±00℃)，应在两周内使用。
3.几种常见培养基的特点
在不同的培养基中，无机盐一般变化较大，有时会因为加入不同的氮源而形成各自的特点。MS是由Murashige，t .和Skoog，f .在1962中设计的培养基。在固体培养诱导愈伤组织、液体培养细胞悬浮培养、胚、茎尖、茎段和花药培养及形态发生研究等方面取得了显著成就。MS培养基中无机营养物质的数量和比例适宜，能满足许多植物细胞的营养和生理需求。因此，一般情况下，培养基中不需要添加有机添加剂，如酪蛋白水解物、酵母水解物或椰子汁。与其他培养基相比，MS培养基中硝酸盐、钾和铵的含量较高，这是其显著特点。与MS培养基类似的还有LS(linsmailer，E.M .和Skoog，F.1965)和RM (Tanaka，1964)培养基，它们的基本成分与MS培养基相同，只是前者去掉了甘氨酸、维生素B6和烟酸，而NH4NO3的用量由后者增加到4950mg/m。与MS培养基相比，White(1963)培养基无机盐浓度较低，但也应用广泛，对胚培养和一般组织培养都有较好的效果。B5培养基由Gamborg等人(1968)设计。其主要特点是含铵量低，可能抑制某些植物的生长。N6培养基是中科院植物所和黑龙江省农科院设计的，也是非常合适的培养基。目前已广泛应用于我国部分植物的花药培养和组织培养。其成分与B5相似，但不含钼。欧洲广泛使用Heller(1953)培养基，无机盐含量低，缺乏钼盐，但含有镍、铝等化合物。
从总的趋势来看，现代培养基倾向于使用高浓度的无机盐。在施氮方面，很多人使用的是硝态氮和铵态氮的混合物，或者只是硝态氮。微量元素的作用研究较少，大多数配方基本接近MS培养基，这些微量元素已经满足了组织培养中愈伤组织和细胞生长的需要。对于铁盐，通常使用FeSO4和Na2-EDTA(螯合剂)的混合物。
二、植物组织和细胞培养在药物生产中的应用
近年来，由于对自然环境的人为破坏、不加选择的采集、劳动力成本的上升以及引进野生植物的技术和/或经济困难，植物资源急剧减少，并且越来越难以确保药用植物的充足供应。自20世纪60年代以来，人们开始应用植物组织培养技术研究植物药物的生产。近年来，随着现代生物技术的发展，成功培养出大量植物细胞，为植物药物的工业化生产开辟了一条全新的新途径。
与一般的整株培养相比，细胞培养体系有很多优点:(1)有用物质的生产在可控的条件下进行，不依赖气候和土壤条件，节约土地；(2)细胞培养无微生物和害虫；(3)生长周期短，缩短了植物引种驯化繁殖的漫长过程；(4)可以进行特定的生物转化反应，探索新的合成路线，获得新的有用物质；(5)通过筛选新的细胞系和改变培养条件，可以提高生产率并降低生产成本。
(一)植物组织和细胞培养技术
1.愈伤组织诱导和培养
愈伤组织是植物组织和细胞培养的基本材料，因此愈伤组织的诱导和培养是植物组织和细胞培养的基础工作之一。
愈伤组织诱导的工作程序大致如下:
(1)植物材料的选择(包括植物种类和部位)；(2)材料的准备和消毒；(3)培养基的选择和制备；(4)接种和培养；(5)亚文化。
目前，许多植物已经成功诱导出愈伤组织，其中双子叶植物最多，单子叶植物最少。此外，裸子植物、蕨类植物和藓类植物也有成功的例子。因此，可以说所有多细胞植物都具有成功诱导愈伤组织的潜力。双子叶植物具有广泛的实用价值，它们能迅速长出愈伤组织。植物的各种组织，如维管形成层、贮藏器官的薄壁组织、根的中柱鞘、胚乳、子叶、叶肉组织和维管束组织，在适宜的条件下都能形成愈伤组织。
愈伤组织诱导大多在固体培养基上进行。固体培养一般在25-28℃进行，每4-6周进行一次继代培养。
愈伤组织培养方法一般可分为固体培养和液体培养。固体培养是指加入一定量的凝固剂(0.6-1.0%琼脂等。)加入到培养基中，加热溶解，分别置于培养容器中，冷却，得到固体培养基。而没有凝结剂那些是液体培养基。
固体培养是静态培养，优点是简单方便，只需要普通玻璃器皿，不像液体振荡培养，不需要摇床、旋转床等复杂的机械设备，占地少。一个小的培养室可以容纳许多培养容器。但固体培养也有以下缺点:愈伤组织表面只有一部分与培养基接触，导致愈伤组织生长不均匀；与培养基接触的底部组织气体交换差，同时生长过程中排出的有害物质堆积；静止放置时，由于重力或光线照射不均匀的作用，组织被极化，很难有一个相当一致的群体。
液体培养可分为静置和振荡两种。液体静态培养和固体培养一样简单，培养液中的营养浓度不会有差异。但由于其使用的局限性，目前已经很少使用。振荡培养是使植物组织在液体培养基中不断旋转，从而消除静态培养中的缺点。振荡培养可分为两类:(1)连续浸没，通过搅拌或振动培养液使组织悬浮在培养基中，常用摇床进行培养；(2)对于那些定期浸没的，使用T型管和乳头瓶作为培养容器，并在旋转床上培养。在旋转过程中，培养物反复出现在液相和气相中。
2.细胞悬浮培养
植物细胞悬浮培养技术是在愈伤组织液体培养技术的基础上发展起来的一种新的培养技术。近二十年来，从试管悬浮培养发展到大体积发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养，直到近年来最新的浊度常数法和化学常数法在大规模连续培养中实现自动控制。细胞悬浮培养的特点是:(1)能提供大量均一的植物细胞；(2)细胞增殖比愈伤组织快；(3)适合大规模培养。因此，可以像微生物一样培养植物细胞，并将其应用于发酵工业，生产植物的一些独特产品，从而为植物产品的工业化生产开辟一条新的途径。细胞悬浮培养是在液体培养基中培养游离的植物细胞，但由于植物细胞具有聚集的特性，到目前为止，还不能在悬浮状态下只制造游离的单细胞，而往往是一些小的细胞团。
(1)悬浮培养的设备和装置
①植物细胞悬浮培养广泛使用摇床。易破碎的愈伤组织通过摇床的连续振荡可以得到分散的细胞悬液。也可用于悬浮细胞的传代培养。
(2)每分钟翻一次床。t型管或奶嘴瓶用作培养容器。
③旋转式培养架可以使用较大的瓶子作为培养容器。
④连续培养设备通常依靠引入无菌压缩空气或空气和连续搅拌的方法来保持细胞悬浮。在这种搅拌装置中，由于用于容纳培养液的容器是固定的，所以用于储存新鲜培养液的容器、空气供应装置等可以容易地与培养容器连接。可以在培养容器中安装一些蛇形管，在管中放入电热丝加热，通入冷水冷却，这样的装置不需要安装在恒温室中。一般这类装置可以简单控制温度、搅拌速度、通风速度、光照强度、营养液流入速度等。，并常与氧电极、pH电极、细胞密度测试仪等连接。，形成一套具有初步自动控制的连续培养装置。几种植物细胞团培养装置包括搅拌发酵装置、使用振荡器的发酵装置、使用导管和旋转叶轮的发酵装置、气泡搅拌发酵装置和气升式发酵装置。
(2)用于悬浮细胞的培养基
常用的适合愈伤组织的培养基不一定是最适合细胞悬浮培养的。通常诱导愈伤组织的培养基可以作为起点来确定最合适的培养基。特别要注意生长素和细胞分裂素的用量对悬浮培养细胞聚集的影响，要选择使细胞容易解离的培养基。
在悬浮培养中，pH值经常变化很大，因此必须加入EDTA等螯合剂，以使铁和其他离子长期可用。硝态氮和铵态氮比例的调整也可以作为稳定pH的方法，加入一些固体缓冲剂，如微溶的磷酸氢钙、不溶的磷酸钙和碳酸钙，也是稳定pH的一种方法。
(3)悬浮细胞的继代培养
悬浮培养过程中，细胞数量增长的变化如图13—1所示。基本上是S型曲线。一开始是延迟期，细胞很少分裂；其次是对数生长期，细胞数量迅速增加，生长速度不变；之后会进入一个逐渐放缓的静止期；最后完全停止了生长期。在培养中，细胞通常在休眠期开始时进行传代培养，有些需要在休眠期之前增殖减缓时进行传代培养，有些甚至需要在对数生长期结束时立即进行传代培养，以便加速细胞增殖。
图13—1是培养一代中细胞数量增长的示意图。
近年来有研究利用DNA合成抑制剂和植物激素处理，使培养中的细胞在一定条件下进入细胞分裂周期的某一时期(如G期)，然后从下一时期开始，大部分或全部细胞同步分裂，称为同步培养。这样，我们不仅可以详细了解细胞周期的真实过程，还可以知道控制从母细胞到子代细胞的生化变化顺序的因素。由于同步培养可以频繁取样进行生化和细胞学分析，取样量可以很大，而且不会影响剩余群体的继续生长，为研究细胞周期、细胞分化、次生代谢等重要过程提供了必要的技术手段，是植物细胞培养技术发展的又一重要进步。
综上所述，目前的植物组织和细胞培养技术已经从静态固体培养发展到液体培养，其特点是提高培养的组织和细胞的营养和供氧。规模和方法正在从小数量向大数量发展，应用上从试管向大罐和同步培养发展，操作上从手工向自动化发展。这些进展和发展对植物组织和细胞培养的研究和生产应用产生了重大影响。
(2)植物组织和细胞培养产生的药物成分。
自从Bonner等人在1950研究紫锥菊属愈伤组织生产天然橡胶以来，许多科学工作者围绕愈伤组织能生产出什么有用物质，如何提高有效成分的产量等问题做了大量的工作，取得了一些成果。越来越多的人认为，利用植物组织和培养细胞，生产用于治疗各种疾病的生物碱、萜类、醌类、甾醇类、酶类等，从培养物中提取肽类和蛋白质类物质是可能的。尼克尔(1980)总结植物组织培养可以产生50多种化合物和28种潜在产物。郑(1980)列出了60多种药用成分、来源植物和药物内容。日本协和发酵公司的Misawa，m .，1980介绍了工业实验室或政府通过植物组织培养生产的生物碱、甾醇、萜类、醌类等生理活性物质包括酶的研究成果。据世界卫生组织统计，从高等植物中提取的最常见、最基本的药物有17种。其中，11药物的来源植物已进行组织培养(表13-4)。
表13-4来自高等植物的常用和基本药物
1.生物碱类
通过植物组织和细胞培养生产生物碱特别困难，但产生生物碱的药用植物的组织培养是研究最多的方面之一(表13-5)。但其含量通常低于原植物。
表13-5植物愈伤组织中的生物碱
表13-5植物愈伤组织中的生物碱(续)-1
(1)东莨菪碱生物碱
莫塞斯、韦斯特、陈、梅斯、木岛正雄、班达里、托马斯、斯托斯、赛拉姆、塔巴塔、平冈、克里奥克希等。对曼陀罗、颠茄、风信子、蜈蚣等植物的根、愈伤组织和悬浮细胞进行了大量的研究。，但没有或很少含有药用物质。West(1957)首先证实颠茄根愈伤组织中存在东莨菪碱类生物碱。根愈伤组织中阿托品的含量为0.47-0.53%。然而，在茎和叶的愈伤组织中没有检测到它。Chan等(1956)对曼陀罗、白花曼陀罗和无毒曼陀罗的不同器官诱导的愈伤组织进行了静态培养和振荡培养，并测定了愈伤组织中生物碱的含量。其中曼陀罗和曼陀罗在种子愈伤组织中含量最高，达到0.016-0.056%，根中0.012-0.015%，茎中0.004-0.014%，叶中0.007-0.067%。结果表明，由于诱导愈伤组织的器官不同，生物碱的产生量也不同。West等人还指出，同一来源的曼陀罗愈伤组织株系之间合成生物碱的能力存在差异。支等(1976)初步测定东莨菪碱和东莨菪碱的含量分别为0.025%和0.009%，低于原植物(分别为0.127%和0.016%)。但由于改进培养条件、增加营养、更换生长调节剂、补充前体物的研究，两种生物碱的总含量达到0.554%(原植株中为0.139%)，东莨菪碱的最高含量达到0.495%(茎中为0.016%)，比原愈伤组织提高了4%。程克迪等(1987)的研究结果表明，山莨菪碱等细胞不仅能产生托品生物碱，还能将东莨菪碱转化为山莨菪碱和东莨菪碱。
(2)吡啶生物碱
在利用组织培养生产吡啶类生物碱的研究中，烟草是最早也是研究最多的。早在1948，Dawson就研究了烟草中生物碱的生物合成。他的1960报道，在粘胶烟草的组织培养中，初期烟碱含量急剧下降，到了典型的愈伤组织时，已经没有烟碱了。然而，Speake等人(1964)证明了烟草(弗吉尼亚品种)的根、茎和叶