荧光素酶的检测值是多少来计算其活性？
荧光素+ATP →荧光素酰腺苷酸)+PPi
荧光素腺苷酸+O2 →氧荧光素+AMP+光
这个反应非常节能，输入反应的能量几乎全部转化为光。与人类使用的白炽灯形成鲜明对比的是，只有10%以上的能量转化为光，其余的能量都转化为热能浪费掉了。
荧光素或荧光素酶不是一个特定的分子，而是所有能产生荧光的底物及其相应酶的总称，虽然它们是不同的。能够控制发光的不同生物使用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。最广为人知的发光生物是萤火虫，它们所使用的不同的荧光素酶与其他发光生物的荧光素酶是不同的，比如平菇(Pleurotus ostreatus，Omphalotus olearius)或者很多海洋生物是不同的。在萤火虫体内，发光反应所需的氧气是从一个叫做腹部气管的管子输入的。一些生物，如磕头虫，含有多种不同的荧光素酶，可以催化相同的荧光素酶底物，发出不同颜色的荧光。萤火虫有2000多种。然而，在瓢虫总科中还有许多其他昆虫(包括萤火虫、磕头虫和相关昆虫)，因此它们的荧光素酶对于分子系统学非常有用。目前，研究最彻底的荧光素酶是来自Photinini萤火虫科的北美萤火虫(Photinus pyralis)。
荧光素酶
又称发光酶，是催化生物发光的酶系统的总称。它是一种高分子成分，在轻物质的冷水提取物在氧气中发光，底物荧光素被消耗后，对热不稳定。目前研究最多的是萤火虫和发光细菌荧光素晶体。它们属于加氧酶，不含金属和辅酶。为了发光，有些酶必须以ATP为辅助因素。其他人没有。众所周知，萤火虫的发光机制因物种不同而有很大差异。荧光素酶具有高度特异性，通常只作用于相关物种的荧光素酶。当然，萤火虫和萤火虫的酶是不能互相替代引起发光的。萤火虫的萤光素酶在干燥状态下相当稳定，可以保存。
双荧光素酶报告基因检测:结合萤火虫和海洋腔肠动物荧光素酶的先进* * *报告基因检测技术
当萤火虫荧光素酶用于定量基因表达时，通常使用第二个报告基因来减少实验中的变异因子。然而，传统的* * *报告基因(如CAT、β-Gal、GUS)由于其不同的测试化学、处理要求和检测特性而不够方便。Promega提供了先进的双报告基因技术。结合萤火虫荧光素酶试验和海洋腔肠动物荧光素酶试验，双荧光素酶报告基因检测系统，结合pRL载体系统，表达第二报告基因海洋腔肠动物荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因检测，快速、灵敏、简便。该系统还提供PLB裂解物来裂解在多孔板中培养的哺乳动物细胞，而无需操作单个样品。对于使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员来说..
介绍
双报告基因用于实验系统中的相关或比例检测，通常一个报告基因用作内部对照，以便另一个报告基因的检测是一致的。当检测基因表达时，通常使用双报告基因来瞬时转染培养的细胞，并且具有实验报告基因的载体转染具有不同报告基因的第二载体作为对照。通常，实验报告基因与受调控的启动子偶联。研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活性的相对变化与偶联调控启动子转录活性的变化有关。与组成型启动子偶联的第二个报道基因提供了转录活性的内部控制，因此试验不受实验条件变化的干扰。
通过这种方法，可以降低由内部变化因素削弱的实验准确性，例如培养细胞的数量和活力以及细胞转染和裂解的效率的差异。
近年来，萤火虫荧光素酶与氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)或葡萄糖醛酸酶(GUS)的双报告基因结合使用已经得到广泛应用。然而，这些双报告基因的组合削弱了荧光素酶操作的优势，如荧光素酶测试和定量可以在几秒钟内进行，但CAT，β-Gal和GUS测试方法，此外，这些报告基因受到其灵敏度和线性响应范围的限制，因此必须注意不要超过这些范围，内源性细胞活力也会干扰此类报告基因的使用。许多类型的细胞具有内源性β-Gal或GUS表达，这不利于报告基因的准确定量表达。细胞内脱乙酰酶活性干扰CAT活性试验。虽然高温预处理细胞裂解液(1，2)会减少内源性β-Gal和CAT试验的干扰，但这些处理也会使荧光素酶迅速失活。因此，在这种双报告基因检测中，需要在不同的步骤中处理用* * *转染的细胞裂解物。
理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶的速度、灵敏度和线性范围同时测定同一样品中的两种报告基因。这在传统的报告基因，如CAT、β-Gal和GUS中是不可能的，因为它们在测试化学中的固有限制。相反，结合firefly (Pyraris)和Renilla reniformis，Promega的双荧光素酶报告基因测试(DLR)系统可以满足这些要求，并在单个试管中完成这些测试。
双荧光素酶报告基因测试化学
萤火虫和海洋腔肠动物荧光素酶都具有生物发光报告基因的优良测试特性，但它们的进化起源不同，因此它们具有不同的酶结构和底物要求。这些差异用于开发DLR测试化学，并选择性区分这两种生物发光报告基因的活性。萤火虫荧光素酶是一种具有61kDa亚基的蛋白质。酶活性可在翻译后用作遗传报告基因，无需翻译后修饰(3，4)。在ATP、Mg 2+和O 2的存在下，通过甲虫荧光素的氧化反应发光(图1)。在常规反应条件下，当荧光素发生氧化时，以荧光素-AMP为中间体的转化非常缓慢。结果，在底物和酶混合后，测试化学产生“闪烁”光，这种光迅速衰减。获得专利的测试试剂，可以量化萤火虫荧光素酶的活性，添加辅酶A(CoA)来增强快速的酶转化，以改善反应动力学(5)，从而产生连续的“闪烁”发光信号(图2)。
图1萤火虫和海肾萤光素酶催化的生物发光
海洋腔肠酶是一种36 kDa的蛋白质，从天然来源肾形海肾中纯化得到(6)，含有3%的碳水化合物。但像萤火虫荧光素酶，其活性在翻译后无需翻译后修饰即可作为遗传报告基因。海洋腔肠酶催化的发光反应，使用O _ 2和腔肠素(图1)，当DLR测试化学用于实验时，海洋腔肠素反应的动力学产生闪烁发光信号，在检测过程中缓慢衰减(图2)。
在DLR测试系统中，用单一裂解物逐步测量萤火虫和海洋腔肠动物的荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性(“实验”报告基因)测定后，萤火虫的发光迅速湮灭，同时海洋腔肠动物荧光素酶的发光反应被激活(“对照”报告基因)。因此，DLR测试系统整合了两种测试化学物质来快速定量* * *表达的两种报告基因。
萤火虫荧光素酶试验的线性范围延伸到酶浓度的8个数量级，可测定实验报告基因酶≤1fg(约10 -20 mol)(图3A)。利用双荧光素酶报告基因检测系统，海洋腔肠动物荧光素酶的线性范围达到酶浓度的7个数量级，下限≤ 10fg。
用双荧光素酶报告基因检测萤火虫和海肾荧光素酶产生的发光。用pGL3转染CHO细胞(1×10 6 /60mm培养板)。
对照和pRL SV40载体DNA。用PBS洗涤细胞后，加入400μl PLB以制备裂解物。将20μl小细胞裂解液与100μl荧光素酶测试试剂II(LARII)混合，荧光光度计立即检测萤火虫荧光素酶的活性(细线示踪)5438+000μl stop &；将Glo TM试剂加入荧光照度计的管中，以消除萤火虫荧光素酶反应并同时激活海肾荧光素酶反应，并且立即检测海肾荧光素酶的活性(粗线追踪)。Turner Designs 20/20型荧光照度计配有计算机以追踪荧光发射，该测试在65438±02秒内完成两次。
双荧光素酶报告基因检测系统的方法
可以在制备裂解溶液后立即定量来自两个报告基因的荧光素酶的发光信号，并且没有必要将样品分成小组或进行额外的处理。因为海洋腔肠动物和萤火虫荧光素酶都显示闪烁反应动力学，所以双荧光素酶报告基因测试不需要带有试剂注射器的荧光照度计。
通常，DLR测试需要大约30秒才能完成，如图4所示。当开始萤火虫荧光素酶报告基因测试时，将裂解产物与荧光素酶测试试剂II (LAR II)混合。当完成萤火虫荧光素酶试验时，萤火虫发光湮灭，同时海洋腔肠动物荧光素酶发光被激活，停止& amp；Glo TM试剂到样本管。在1秒内，停止&；Glo TM试剂湮灭滴度大于1.05的萤火虫反应发光信号(图5)，同时激活海洋腔肠动物荧光素酶。
图3萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶发光反应的线性范围。纯化的萤火虫和海肾萤光素酶用含1mg/ml BSA的1×PLB连续稀释。配备有计算机的Turner Designs荧光照度计用于检测65438±00秒的总荧光。在前2秒的预读延迟后，直接检测两种高浓度荧光素酶的发光反应时，在荧光照度计的样品室中加入中性密度滤光片。在含有10fg和100fg的海肾萤光素酶反应中，减去了来自海洋内腔萤光素酶自发光的背景信号。两种荧光素酶的发光活性相对于它们各自的测试变化浓度作图。
图4。用手动荧光照度计或配有试剂取样器的荧光照度计进行双荧光素酶试验的方法。例如，如果荧光照度计配备了两个取样器，则裂解物被预先包装到荧光照度计的管中，然后荧光素酶测定试剂II (LAR II)，stop & amp；GloTM试剂。
PLB裂解物
PLB裂解液缓冲液，特别设计，可有效裂解培养的哺乳动物细胞，无需刮擦贴壁细胞或冻融循环。虽然PLB被设计用于被动裂解过程，但其可靠的裂解效果也有益于通过常规处理方法制备的裂解物。无论使用何种裂解方法，对于培养的哺乳动物细胞，释放到PLB裂解液中的萤火虫和海洋腔肠动物酶报告酶都是定量和可靠的(图6)。被动裂解物的一个明显优点是可以抑制低水平的非酶发光(自发光)，这是海洋腔肠动物在水溶液中的固有特征。常用于制备细胞裂解液的试剂能增强海洋腔肠动物的自发光，包括Triton？X-100，Promega的细胞培养裂解试验？(CCLR)和报告基因切割试剂(RLB)，它们也能显著抑制海洋腔肠动物荧光素酶的发光反应。PLB是专门为最大化荧光素酶活性和最小化自发光而设计的，它可以提供最佳的测试灵敏度，并定量非常低水平的海洋腔肠动物荧光素酶。此外，PLB抑制起泡，这非常适合于高通应用，并可用于自动系统中，以将在多孔板中培养的细胞群制备成裂解物并对其进行测试。
图5双荧光素酶报告基因测试系统消除萤火虫荧光素酶发光并激活海肾荧光素酶发光。CHO细胞裂解物含有* * *转染的pgl 3-对照和pRL SV40载体DNA，其根据图2中描述的方法制备。在10秒内检测萤火虫荧光素酶(报告基因1)和海肾荧光素酶(报告基因2)的活性。Glo TM试剂湮灭报告基因1的高效性，加入等体积的stop & amp；Glo TM试剂(没有海洋腔肠素，海肾萤光素酶反应不能被激活)，萤火虫萤光素酶发光被湮灭而不激活海肾萤光素酶发光。在该实验中，被消灭的萤火虫荧光素酶反应的残余发光小于未受损伤的反应值的0.0004%。