MSK-影响技术文件
MSK-IMPACT可以通过对肿瘤组织的FFPE样本和正常样本进行面板捕获、NGS测序和字母分析，广泛检测基因组中的肿瘤基因突变。它的测序平台是Illumina HiSeq？2500测序仪(MSK合格)，检测到的突变类型有SNVs、Indel(
附表附录1a列出了MSK-IMPACT的检测热点，附表附录1b列出了468个基因及其对应的转录本信息，附表附录1c列出了73个基因和外显子区域信息，由于Panel覆盖深度较低，没有报道。
质量控制要求肿瘤细胞含量大于10%，切片含量大于20%，MSI检测肿瘤细胞含量大于25%。
省略
利用纯合位点一致性从同一样本中检测正常样本和肿瘤样本的配对，可以预期配对样本的纯合位点不一致性较低(；5%)，它被标记为“可能不配对”类型。
检测杂合子位点不同等位基因的频率，如果频率异常，将样本标记为“可能污染”类型。
正常样品不应含有SNVs和INDEL。分析过程将检测正常样本中的变异热点，如果有任何热点的变异频率>；1%，标注样本。
SNVs( MuTect软件)和INDELs( SomaticIndelDetector软件)调用突变过程需要正常和肿瘤配对样本，如果正常样本缺失或者正常样本的平均测序深度较低(
NC样品的分析用于确保没有污染，PC样品的分析用于确保分析的灵敏度。
肿瘤样本的质量控制要求98%的外显子覆盖200X以上，配对正常样本深度50X以上。
最初的SNV和因德尔突变需要通过以下系列进行筛选，以确保所报告突变的准确性。
(1)VF tumor/VF normal & gt；=5，AD & gt=5，VF & gt=1%
(2)突变是否在热点突变库中，附录1a为热点列表。
(3)热点:DP & gt=20，AD & gt=8，VF & gt=2%;非热点:DP & gt=20，AD & gt=10，VF >=5%
(4)过滤注释结果，保留位于外显子区域的非同义突变和移码突变。
MSK-IMPACT覆盖的所有MSI站点的状态由MSIsensor软件计算。MSIsensor将计算一个分数，如果阈值大于10，将标记为MSI-H..
患者的组织或外周血作为正常样本，如果批量使用不成对的正常样本，可能会有一些罕见的种系突变作为体细胞突变。
阳性对照是三个阳性样本的混合物(每个样本包含不同类型和频率的突变信息)，阳性对照的正常样本是统一批次的正常样本的混合物。经过过程分析后，对分析结果进行检验。(1)是否检测到已知突变？(2)检测到的突变频率是否与原始样本一致？表2是已知突变频率的样本。
阴性对照样本为经前期重复实验证实的无肿瘤污染、无种系拷贝数突变的FFPE正常样本的混合物。以前的分析已经确定了正常样本的特定多态性和频率，并将该过程产生的862个SNP的突变频率与预期的突变频率进行比较，以计算皮尔逊一致性。预期的突变频率应该大于0.9
无模板控件(NTC)
样本质量控制指标:
这里使用功率分析的概念来计算所需的覆盖深度。
1a外显子覆盖深度的测定:
当潜在最小检测线设置为2%时，可以通过功效分析计算出显著水平的读取深度。例如，当突变频率为10%时，在500X深度的95%置信区间下，突变频率的范围在7.5%-13%之间。
因此，通过等摩尔混合10个不相关的FFPE正常样本，产生一系列预设的突变频率，最低突变频率为5%。然后用862个SNPs验证预设突变频率和真实突变频率之间的关系。最后，实验数据支持用5%作为报告检测到突变的下限，实际潜在频率为10%。
在运行中和运行之间设置复制品，每个样品5个复制品。
1a面板精度验证(标准验证)
10个样本(9个FFPE样本和一个商业细胞系)代表不同的肿瘤类型、不同的突变类型(突变类型已知)和不同的突变频率(突变频率已知)。
2b面板精度和重复性一致性验证(标准验证)
当评估已知突变的精确度时，表6还验证了在重复样本中检测到的除已知突变以外的其他突变的可重复性。
在5个重复样本中检测到的所有突变的一致性
在五个样本中检测到的突变频率的一致性
表7列出了10个测试样品的精密度验证结果(每个样品重复5次)。
LoD是在95%的重复中可以稳定检测到的突变的等位基因频率。这部分是验证假设突变的LoD。测试分为两部分。第一部分是梯度稀释，以确定可靠的最小突变频率；第二部分是在多次重复中验证LoD。
1a梯度稀释
选取10个FFPE样本，选取覆盖率最高的5个外显子和覆盖率最低的5个外显子。准备5-8个梯度稀释液。
检测结果表10
1a SNV/indel突变方法的比较
比较了MSK冲击法和MSK冲击法经过正交验证后的原始结果。* * *在433份FFPE样本中检测到20个基因的48个外显子，共检测到267个独特的突变位点。已知突变* * *在433个样品中的432个样品中被检测到，并且一个样品中EGFR基因的插入被遗漏。
签出一致性表15A-C-C。
MSK报道的突变有两种:一种是具有临床意义的癌突变，另一种是具有潜在意义的癌突变。
1a临床样本的验证
MSK对超过10，000名晚期癌症患者进行了测试，并将医疗记录和突变信息存储在以下网站上。
https://www.cbioportal.org/study/summary? id = MSK _ impact _ 2017
https://www . access data . FDA . gov/cdrh _ docs/reviews/d EN170058 . pdf