分子标记的优势是什么？
1.1 ?1代分子标记
1.1.1 ?RFLP标签技术。
Botesin在1980提出的限制性片段长度多态性(RFLP)可作为遗传标记，开创了DNA多态性直接应用的新阶段，是最早的分子标记技术。RFLP是检测限制性内切酶消化后形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同限制性位点的分布。因此，DNA序列的微小变化，甚至是65，438+0个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切割位点的丢失或产生，导致限制性内切酶片段长度的变化。
优点:RFLP标记的等位基因具有* * *显性的特点，结果稳定可靠，重复性好，特别适合构建遗传连锁图谱。
缺点:在RFLP分析中，需要该位点的DNA片段作为探针，放射性同位素和核酸杂交技术既不安全也不容易自动化。此外，RFLP对DNA多态性检测不敏感，在RFLP连锁图上有许多大的空间区域。
1.1.2 ?RAPD标记技术。
为了克服RFLP技术的缺点，Williams在1990建立了随机扩增多态性DNA (RAPD)技术。由于其独特的检测DNA多态性的方式，RAPD技术迅速渗透到基因研究的各个领域。RAPD是一种基于PCR的分子标记技术。基本原理是用一个随机引物(8 ~ 10碱基)通过PCR反应随机扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，研究DNA多态性。对于任何特定的引物，在基因组DNA序列中都有其特定的结合位点。一旦基因组在这些区域有DNA片段插入、缺失或碱基突变，这些特异性结合位点的分布就可能发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生变化，表现出多态性。
优点:与RFLP相比，RAPD技术简单，检测快速，DNA消耗少，实验设备简单，无需DNA探针，设计引物时无需预克隆、标记或序列分析，不受物种特异性和基因组结构的影响。一套合成的引物可用于不同生物的基因组分析，一条引物可扩增多个片段，不需要同位素，安全性好。
缺点:当然RAPD技术受多种因素影响，实验的稳定性和重复性较差。首先是显性遗传，不能识别杂合子位点，使得遗传分析相对复杂。在基因作图和连锁遗传作图中，由于显性覆盖，计算基因座间遗传距离的准确性属于特异性和基因组结构。一套引物可以用于不同生物的基因组分析，一条引物可以扩增多个片段，而且不需要同位素，安全。当然，RAPD技术受多种因素影响，实验的稳定性和可重复性较差。首先是显性遗传，不能识别杂合子位点，使得遗传分析相对复杂。在进行基因作图和连锁遗传作图时，由于显性覆盖，计算基因座间遗传距离的准确性会降低。其次，RAPD对反应条件非常敏感，包括模板浓度和Mg2+浓度，因此实验的可重复性较差。
1.3 ?AFLP标记技术
？扩增片段长度多态性(AFLP)又称选择性限制性片段扩增2 (SRFA)，由荷兰KEYGENE公司的Zabean和Vos于1993年发明，并已申请专利。AFLP是近年来发展迅速的一种分子标记技术。它将基因组DNA经成对限制性内切酶消化后的片段与一个接头(与限制性位点互补)连接起来，通过5’端与接头互补的半特异性引物扩增大量DNA片段，从而形成指纹的分子标记技术。AFLP指纹是孟德尔显性和隐性遗传。
优点:兼有RAPD和RFLP的优点，稳定性高。用少量的选择性引物可以在短时间内检测到大量的基因座，每对引物检测到的许多基因座或多或少随机分布在多条染色体上。每条染色体上AFLP标记的数量与染色体长度呈正相关(r = 0。501)，而一对引物涉及的染色体数与标记数呈正相关(r = 0。因此，可以通过少量高效的引物组合获得覆盖全基因组的AFLP标记。目前，AFLP作为一种高效的指纹技术，在遗传育种研究中发挥了其优势。
缺点:但也有研究认为AFLP对基因组纯度和反应条件要求较高。此外，当用于遗传作图时，少数标记与图谱的紧密度不同。此外，基于RAPD和RFLP技术，建立了scar(序列表征扩增区)、caps(裂解扩增多态性序列)和daf (DNA am 2扩增指纹)。这些技术的出现，进一步丰富和完善了1代分子标记技术，增加了人们对DNA多态性的研究手段。
1.2 ?第二代分子标记
2.1 ?SSR标记技术。
真核生物基因组中存在许多非编码重复序列，如重复单元长度为15 ~ 65个核苷酸的微卫星DNA(重复单元长度为2 ~ 6个核苷酸的小卫星DNA。微卫星和微卫星DNA分布在全基因组的不同位点。由于重复单元的大小和顺序不同，拷贝数也不同，构成了丰富的长度多态性。摩尔在1991年结合PCR技术创立了SSR(简单序列重复)标记技术。SSR又称微卫星DNA，是一种由若干个模体(多为1 ~ 5)串联重复组成的DNA序列，其中最常见的是二核苷酸重复序列，即(CA) n和(TG) N，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单元数为10 ~ 60，其高度多态性主要来源于串联的数目。不同遗传物质的重复次数不同导致SSR长度的高度变异性，这是SSR标记的基础。SSR标记的基本原理:根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复次数不同，扩增出不同长度的PCR产物，是检测DNA多态性的有效方法。微卫星序列具有高度多态性，在群体中具有* * *显性，是一种很好的分子标记。目前，微卫星标记已被用于构建人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。
优点:这些微卫星标记已广泛应用于基因定位与克隆、疾病诊断、遗传分析或品种鉴定、作物育种、进化研究等领域。此外，SSR标记不仅可以鉴别纯合子和杂合子，而且结果更加可靠，方法简单，省时省力。
2.2 ?ISSR标记技术。
ISSR是一种新的分子标记技术。1994年，Zietkiewicz发展了SSR技术，建立了锚定微卫星寡核苷酸技术。他们使用锚定的微卫星寡核苷酸作为引物，即在SSR的5’端或3’端添加2 ~ 4个随机选择的核苷酸，可以引起特定位点的退火，从而导致与锚定引物互补的重复序列之间基因组片段的PCR扩增。这种标记也被称为ISSR
序列重复)、assr(锚定简单序列重复)或AMP2PCR。在使用的双翼引物中，一个可以是ASSR引物，另一个可以是随机引物。如果一个是5’端有锚的ASSR引物，另一个是随机引物，称为RAMP技术[19]。ISSR2PCR扩增使用的引物通常是16 ~ 18碱基序列，由1 ~ 4碱基串联重复序列和几个非重复锚定碱基组成，从而保证引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合，通过PCR反应扩增SSR之间的DNA片段。
优点:SSR在真核生物中的分布非常普遍，进化和突变的速度非常快，所以锚定引物的ISSR2PCR可以检测基因组中很多位点的差异。与SSR-2 PCR相比，ISSR-2 PCR使用的引物不需要事先进行DNA测序，这也是为什么有些ISSR引物在特定的基因组DNA中可能没有配对区域，没有扩增产物，通常是显性标记，孟德尔遗传，具有良好的稳定性和多态性。
1.3 ?第三代分子标记
3.1 ?SNP标记技术。
单核苷酸多态性(单核苷酸？多态性，SNP)被称为第三代DNA分子标记，是指同一位点不同等位基因之间单个核苷酸的差异，包括单个碱基的缺失或插入，更常见的是单个核苷酸的取代，常发生在嘌呤碱基(A和G)和嘧啶碱基(C和T)之间。SNP标记可以帮助区分两个个体之间遗传物质的差异，被认为是最有前途的遗传标记。目前，已经在人类染色体上定位了2 000多个标记，在拟南芥中开发了236个SNP标记。大约30%的SNP标记含有限制性位点的多态性。
优点:检测SNP最好的方法是DNA芯片技术。最新报道的微芯片电泳可以高速检测临床样本中的SNP，比毛细管电泳和平板电泳分别快10和50倍。SNP与1代的RFLP和2代的SSR有两方面的不同:一是SNP不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而是直接以序列变异作为标记；其次，SNP标记分析完全抛弃了经典的凝胶电泳，取而代之的是最新的DNA芯片技术。
3.2 ?EST标记技术。
表达序列标签(EST)是由美国国立卫生研究院(NIH)的生物学家Venter在1991中提出的。随着人类基因组计划的开展，EST技术被广泛应用于发现新的人类基因、绘制人类基因组图谱和识别基因组序列编码区等研究领域，进而被广泛应用于植物基因组研究。EST是指在不同组织的cDNA文库中随机克隆测序，获得部分cDNA序列。一个EST对应于某个mRNA的cDNA克隆序列，长度一般为150 ~ 500 bp，只包含基因编码区。
优点:EST可以代表一个生物体在某一时刻的一个表达基因，因此被称为“表达序列鉴定”；然而，ESTs的数量显示了它所代表的基因的拷贝数。一个基因表达的次数越多，它的cDNA克隆就越多。因此，通过对cDNA克隆进行测序和分析，可以知道基因的表达丰度。目前一般采用试剂盒来构建cDNA文库，DNA测序技术的快速发展使得进一步降低大规模DNA测序的成本成为可能。