什么是园艺植物生物技术？
在1983首次获得烟草和马铃薯转基因植株后，McGrananhan等人[1]在1988。
获得了第一个转基因果树——核桃。1990，他们获得了抗虫基因核桃。宰仁
在科学家通过粒子轰击获得大田作物转基因三年后，粒子轰击成功应用于番木瓜[2]
。在1994中，卡林斯基统计了转基因植物的专利，包括巧植和苹果。国内研究人员
高度重视转基因研究。黄学森等人[3]发表了葡萄的遗传转化；程家声等[4]
介绍了苹果基因转移技术。随后，转基因苹果幼苗[5j；傅润民等人。
系统介绍了基因工程及其在果树上的应用[6，7]
；中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点
实验室已经开展了转基因番木瓜的工作[8 ~ 11]
；中国农业科学院柑桔研究所和华南农业大学研发了抗菌皮肤。
柑橘基因转移的研究[12，13]；沈阳农业大学获得了苹果主栽品种‘新乔纳黄金’[14 ~ 16]的转基因植株。
福建农业大学开发了龙眼[17]和西番莲[18]。
蝙蝠蛾等亚热带果树的遗传转化和转基因研究；壮丽的
中国农业大学等在方法论上推动了果树基因工程的进展[19，20]
。也进行转基因或遗传转化。
多单位[21 ~ 24]
。果树转基因研究已成为热点。作者试图对迄今为止的果树转基因文献进行总结，同时也对一些问题提出了自己的看法。如有不当之处，欢迎批评指正。植物基因转化的方法1.1农杆菌介导的基因转化方法
在目前已经讨论的各种基因转化方法中，农杆菌基因转化方法是研究得最清楚的一种[25]
。这种方法利用自然界的自然基因工程系统，即根癌农杆菌和发根农杆菌的致病过程，将人工加工的基因转化到人类植物细胞中。根癌农民
细菌感染植物并引起冠瘿。冠状薄瘤有两种状态[26]
一种是无组织的肿瘤，在无激素培养基上增殖，但没有顶端优势，难以生根。与冠状薄瘤诱导相关的质粒为Ti质粒(Tum。:inducingplas-mid).发根农杆菌能在感染部位产生许多毛根，这与Ri质粒有关。只有能被农杆菌侵染的植物才能用农杆菌作为基因载体。农杆菌主要侵染双子叶植物，单子叶植物一般对这两种病菌不敏感，但最近也有不少侵染发病的案例，裸子植物也可以人工接种致病。
目前，有三种常用的农杆菌转化方法[
25〕
(1)植物伤口直接感染:用小刀从新萌发的种子、幼胚、子叶或茎段上切下一个伤口，接种过夜培养的根癌农杆菌，然后在无激素培养基上培养肿瘤组织。这种方法实验周期短，但肿瘤组织中往往存在未转化细胞，容易形成嵌合体。(2)叶盘转化法:用打孔器从幼嫩和新鲜叶片上取下直径为3-smm的叶盘，在过夜培养的农杆菌液中浸泡几秒钟，然后转移到培养基中2-3天，再将叶盘转移到含有抗生素的选择性培养基中诱导幼苗分化，使转化细胞直接再生植株。该方法简单可行，可快速获得转基因植株。(3)原生质体培养法:原生质体再生细胞壁并分裂时，其行为与植物伤口细胞相似。这时，农杆菌可以感染原生质体。在原生质体中加入根癌农杆菌(1:100 ),培养24~40h。然后，通过离心将原生质体灭菌，并在选择的培养基上培养，以诱导愈伤组织再生植株。由于原生质体的遗传同质性，转化细胞是单一的独立细胞，获得的转化子一般不存在嵌合体，具有很大的应用价值。1.2DNA的直接转化
由于农杆菌宿主范围的限制，很难通过农杆菌转化作为作物主要部分的谷类。因此在20世纪80年代发展了直接导入DNA的技术，即将裸露的DNA经过特殊处理后直接转移到植物体内。
1.2.1聚乙二醇:PEG)PEG) PEG是原生质体融合的介体，可以影响质膜的通透性。培养质粒DNA***时，原生质体主动吸收外源DNA分子，外源基因可以整合到植物基因组中进行表达和传递。PEG处理后，大量原生质体与DNA分子接触，然后在高Ca″+和高pH溶液的作用下，质膜电荷重新分配，表面出现一些暂时可变的小孔，DNA分子进入原生质体。当用培养液洗涤原生质体改变PEG、高CaZ+和高pH的条件时，原生质体恢复到原来的形状，进入原生质体后的DNA分子可以进入细细胞。
在细胞核内，整合到染色体中[25]
。这种方法相对简单易操作，不需要昂贵的仪器设备，但需要一个原生质体制备、培养和再生体系。
1.2.2电穿孔:将原生质体和DNA分子在缓冲液中混合，置于小容器中进行短时高脉冲电处理，使细胞膜上的孔可恢复，产生新的渗透孔(3-4nm)，从而使与原生质体膜直接接触的DNA分子进入细胞。质膜中可逆孔的大小和数量取决于电场强度和穿刺时间。目前，这种方法大多局限于标记基因，旨在建立高效转化。
系统巨人[27]
。
1.2.3基因枪法又称partile blanching或高速粒子微突法，是一种机械转移基因的方法。通过加入Ca'+和亚精胺将DNA吸附在钨和金颗粒表面，制成DNA微球，在基因枪的瞬间作用力下进入人体植物细胞。这种方法最大的优点是应用广泛。但由于受轰击速度、靶细胞距离、微弹直径和速度、射击扩散半径、外源DNA的数量和结构等因素的影响，转化频率较低，且存在价格高、嵌合体难以排除、转化子难以选择等因素，限制了其应用。
1.2.4除上述常用方法外的其他转化方法，如显微注射、脂质体融合、超声冲击、显微激光电泳等。已应用于植物基因转化。影响果树基因转化的三个因素
2.2.1根癌农杆菌感染性和载体的影响
农杆菌的感染性直接关系到转化率，也是转化成败的主要因素之一。农杆菌的传染性取决于农杆菌本身的特性和受体植物对它的敏感性。就农杆菌而言，其传染性与农杆菌的种类和载体质粒的结构有关。农杆菌可分为三种类型，即胭脂碱型(Nop)、奥科平型(Oct)和农杆菌碱型(琥珀碱型)。Nop菌株的特点是染色体背景为C58，生长速度快，不起球，操作简单。常用的工程菌株有C58、pGV3850、A208SE等。Oct菌株的特点是其染色体背景Achs，生长缓慢，菌株培养。
培养过程中结瘤不利于转化实验中的操作，且* * *培养后不易洗掉。常用的工程菌株有LBA4404和LBA104。Suc型毒株的特征是其染色体背景为A281或A136，具有Nop型毒株的特征。常用的工程菌有EHA101和EHA105，具有生长快、不起球等优良特性，两者都具有很强的传染性。我们对菌株对各种果树的感染性进行了比较研究。结果表明，EHA105是理想的果树转化载体系统。该菌株具有生长快、不起球、转化易操作、培养后易洗脱、对Cef敏感、感染性强、宿主范围广等特点。利用该菌株我们已经成功获得了苹果、樱桃、草莓等多种转基因植物。2.2.2根癌农杆菌中vir基因的激活
vir基因的激活是农杆菌转化的结构域阀门。Vir区包含7个操纵子virA，b，c，d，e，f，g和h * * *和24个基因，所有这些基因都起调节作用，它们与T-DNA的加工和转移有关。vir基因的激活在农杆菌转化中起着重要的作用，因此任何能增强vir基因激活的因子都可以提高其感染性。vir基因常用的诱导剂是乙酰丁香酮(As)。关于诱导剂的使用，常用以下三种方法:①在农杆菌液体培养物中加入AS，加入时间一般在工程菌感染液配制前4~6小时。(2)将as加入到土壤杆菌属的培养基和外植体中(3)将AS加入到土壤杆菌属的液体培养基和土壤杆菌属的培养基中。这种方法似乎是最可靠的，但作为诱导剂使用太多。然而，许多实验表明，转化可以在没有诱导物的情况下实现。此外，在苹果叶片的转化中，发现与as同时添加甜菜碱(lmmol/L)或脯氨酸(lumol/L)对vir基因的激活有协同作用。发现pH值对vir区的激活有明显的影响。理论上，当含AS培养基的pH值为5.0~5.6时，vir区的基因诱导达到最高水平，pH值变化0.3，对许多植物的转化率有明显影响。章鱼碱和农杆菌碱菌株比胭脂碱菌株需要更低的pH值。通常情况下，土壤杆菌的pH值为7.2。这种强毒株的病毒基因都是不活跃的。植物组织培养基中的pH值通常为5.8，有利于vir基因的激活。在诱导vir基因激活的过程中，应注意调节培养基的pH值。此外，vir基因的激活还受其他因素的影响，如温度，virD和virG的激活必须低于28℃；培养基中还应加入酵母提取物；培养基中糖或高浓度的肌醇能促进vir基因的表达。
植物转基因研究中的问题与对策
通过转基因技术，我们可以优化植物的农艺性状，获得良好的经济效益，并取得了显著的成就...尽管如此，植物转基因研究仍然存在一些潜在的问题。
影响蛋白酶活性的抑制基因被引入植物后，以其叶片为食的昆虫的消化功能会受到损害。转基因植物的叶子、果实和种子会对人和动物产生类似的危害吗？其他种类的基因导入植物后，人和动物会有什么变化？虽然没有直接证据证明转基因植物对人和动物是否有害或危害程度如何，但这种怀疑让人担心. 3.2病虫害的抗药性
病虫害的抗药性是困扰农业生产的一大难题。最近的研究表明，如果每年喷洒苏云金芽孢杆菌杀虫剂10~20次，五年后害虫死亡率降低50%，其半衰期剂量增加10倍。如果大规模种植能够自行产生苏云金杆菌毒素蛋白的转基因植物，可能会出现类似的情况。此外，由于生物的共同进化，抗性植物可以在不利条件下生存，因此病虫害会迅速发展其对不良生境的适应性，使转基因植物逐渐失去对病虫害的抗性。3.3环境和生态平衡问题
目标基因导入植物后，植物的性状得到了改善。但是，如果这些基因被一些野生植物，特别是一些杂草捕获，就会产生一些新类型的杂草。例如，除草剂对清除具有抗除草剂基因的杂草不再有效。如果抗逆基因被杂草捕获，它们对环境的适应能力和生存竞争力就会增强，从而加剧它们的增殖和扩散。一些珍稀植物物种会因竞争替代而灭绝，同一种植物的遗传多样性会降低，昆虫群落也会受到影响。
尽管转基因研究带来了上述问题，但随着研究的深入，人们会寻求新的对策来解决这些问题。我们应该通过立法等手段加强对转基因研究的管理，最大限度地减少转基因研究的负面影响。通过时间、空间、基因隔离等手段，基本可以控制植物基因的传播，减少其对生态环境的危害。
转基因技术展望
将外源基因定点、定量地导入受体细胞的基因组DNA中，获得稳定、高效表达和遗传的新个体，是转基因研究的主要目标。随着生物技术产业化的加速，转基因技术将发挥越来越重要的作用。
(1)利用多基因转化培育超级抗虫新品种许多病毒、真菌、细菌和害虫不仅给果树生产造成了巨大的经济损失，而且由于农药的大量使用造成了环境污染。许多抗虫基因已被克隆，如cp、bt、icp、cpti、抗菌肽、几丁质酶、雪莲凝集素、PRP基因等。，为培育抗病新品种奠定了基础，但这些基因具有很强的特异性，只能对某一类病虫害有效。近年来，植物基因工程的重要进展是人工染色体载体的构建、多基因转化体系的建立和多基因转化的实现。这些新进展为将多种不同类型的抗虫基因导入果树奠定了基础，也为培育具有一般抗虫性的超级新品种开辟了新途径。
(2)利用基因工程培育新砧木。果树新砧木的培育是一个重要的研究课题。果树的抗逆性、矮化、高产和生根能力都与砧木有关。目前有很多抗逆基因、生根激素基因、矮化基因等。将这些基因导入现有砧木将有力地促进果树产业的发展。而且砧木基因工程育种几乎没有转基因的安全问题，容易被社会接受。
(3)利用反义基因操作培育耐贮藏的新品种。根据反义RNA的原理，人工构建反义基因，导入细胞表达与靶mRNA互补的部分序列，然后与之配对形成复合物，从而阻断DNA从RNA到蛋白质的信息流，调节靶基因的表达。反义基因操作技术在植物基因工程中的应用取得了可喜的成果。
(4)提高水果品质。到目前为止，已经克隆了许多与果实品质相关的基因。如果将这些基因导入果树，如多糖合成酶基因、海藻糖合成酶基因、甜蛋白基因、赖氨酸等必需氨基酸合成酶基因，将培育出优质的新品种。