分子标记在辣椒种质资源研究中有什么应用？
一、种质资源的鉴定和分类
分子标记技术可以快速构建种质资源的指纹图谱，为种质资源的鉴定和分类、优良种质资源的知识产权保护和核心种质库建设提供了更加客观的依据。
(1)朝天椒和北柴胡的鉴别
朝天椒和北朝天椒在形态上相似。辣椒属植物分类学中的一个长期争论是朝天椒和北朝天椒是两个不同的种还是同一种中的两个不同类型。美国新墨西哥州立大学的研究人员通过RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态DNA)标记分析发现，朝鲜蓟品系间的平均遗传相似系数为0.85，北朝鲜蓟品系间的平均遗传相似系数为0.80，而朝鲜蓟和北朝鲜蓟品系间的平均遗传相似系数仅为0.38(Bl和Bosland，2000)。根据这一强有力的证据，结合它们之间形态性状的差异以及杂交后代繁殖力降低的事实，他们认为朝鲜蓟和北朝鲜蓟是两个不同的物种
(2)栽培辣椒起源中心和次生中心的遗传多样性比较。
栽培辣椒(C.annuum var.annuum)起源于墨西哥，于15世纪由航海家哥伦布带到欧洲，后传播到亚洲和非洲。亚洲、中欧和南欧以及非洲被认为是胡椒的次级中心。尼泊尔广泛种植辣椒，当地农民保存了大量的当地品种。RAPD标记的聚类分析表明，当遗传相似系数设置为0.80时，尼泊尔的所有地方毒株被聚在一起，而墨西哥的毒株可分为8个不同的类群(Bl和Bosland，2002)。这说明由于洲际迁徙，尼泊尔胡椒种群已经过了一个进化瓶颈，遗传背景狭窄。我国湖南、云南、四川、陕西等省也有许多地方品系，是我国辣椒育种的主要遗传材料。尼泊尔的案例对我国辣椒种质资源的研究应该有所启发，即在收集中国特色辣椒种质资源的同时，更应重视辣椒起源中心墨西哥种质资源的收集，因为起源中心拥有更丰富的基因库。
二、辣椒分子标记的遗传图谱
遗传图谱是遗传育种研究的基础工具，也是挖掘种质资源中有益基因特别是数量性状基因的蓝图。在分子标记诞生之前，只有玉米、番茄等少数作物有相对完整的遗传图谱。分子标记的诞生为遗传图谱的构建提供了极大的便利。辣椒分子遗传图谱的建立得益于其与模式作物番茄的亲缘关系。番茄和辣椒的比较遗传学研究表明，虽然辣椒的基因组进化发生了很大的重组，导致辣椒的基因组比番茄大3-4倍，基因的序列差异很大，但这两种茄科作物的基因内容却极其相似。所有测试的番茄cDNA探针都能与辣椒基因组DNA杂交(Tanksley等，1988)。这些探针的RFLP标记构成了辣椒分子遗传图谱的骨架。到目前为止，研究人员已经发表了10张辣椒的分子遗传图谱，但最具代表性的是康奈尔大学和法国农业科学院发表的两张图谱。
康奈尔大学图谱(CU-Map)中所用的群体是一年生黄栌×北五味子种间杂交的F2代群体。该图谱包括11个大连锁群(76.2 ~ 192.3 cm)和2个小连锁群(19.1和12.5cM)，总覆盖范围为1245.7cM结果表明，它们之间有18个同源连锁片段，覆盖了番茄基因组的98.1%和辣椒基因组的95%。通过这个图谱和马铃薯图谱，他们确定了引起这三种重要茄科作物进化分化的染色体重组类型和次数，重建了这三种作物同一祖先的理论图谱。这些染色体重排包括5个易位、10个臂内倒位、2个臂内倒位和4个染色体分离/联合。作图群体的双亲之间也有三个染色体重排。CU-MAP***标记了包括RFLP、RAPD、AFLP(扩增片段长度多态性)和同工酶在内的677个标记，平均每1.8cM标记1个，但由于染色体上标记分布不均匀，54%的标记集中在着丝粒附近，使得CU-MAP骨架图的标记密度为9cM/标记(Livingstone等，1999)。这个标记密度对于胡椒来说是理想的。
法国农业科学院INRA-MAP使用的三个群体都是一年生黑麦草种内杂交群体，包括两个DH(双单倍体)群体(HV-H3×Vania和PY-多年生×Yolo Wonder)和一个F2群体(YC-Yolo Wonder×criollo de Morelos 334)。由于常规育种中使用的种质资源主要来自于一年生黑麦草，种内杂交图谱可以更好地用于分析育种中实际使用的基因库，可以直接为育种服务提供分子标记。例如，这三个群体中的一个亲本对CMV和疫病有部分抗性，而另一个亲本对这两种重要病害高度敏感。HV和PY是DH群体，属于永久群体。他们可以多年反复观察各种数量性状的遗传。以Palloix博士为首的法国农科院辣椒育种组也准备将YC群体转化为永久RIL(重组近交系)群体，以研究抗疫病这一重要数量性状(Palloix，个人通讯)。* * *、PY和YC图谱上分别标记了543、630和208个标记位点(包括RFLP、RAPD、AFLP、PCR、同工酶和形态标记)。通过整合这三个图谱，他们绘制了一个包含12个大连锁群的整合图谱，与单倍体辣椒的染色体数目一致，与CU-MAP的研究结果相似，并且这个整合图谱与番茄图谱的关系非常复杂(Lefebvre et al .，2002)。
许多控制园艺性状的基因或数量性状位点(QTL)已经定位在分子标记遗传图谱上(表26-1)，所述园艺性状例如抗病性、成熟度、雄性不育性、辣味、果实颜色、果实重量和果实形状指数。这为通过标记辅助选择(MAS)对许多性状进行种质资源的改良和创新提供了条件。
表26-1辣椒中定位的基因或数量性状位点
表26-1辣椒的定位基因或数量性状位点(续)-1
3.分子辅助筛选在种质资源改良和创新中的应用
种质资源中有益基因的利用方式有两种:表型选择和基因选择(Tanksley和McCouch，1997)。表型选择法对于单基因控制性状的育种是成功的，如辣椒抗根结线虫育种。但由于性状鉴定的限制，表型选择只能操作有限数量的基因。对于大多数重要的辣椒数量园艺性状，如产量、抗CMV、抗枯萎病和果实性状，表型选择方法有很大的局限性，会遗漏许多有益基因。基因选择法可同时选择多个基因位点，可在苗期进行选择，提高种质资源改良创新(特别是遗传复杂数量性状的改良)的效率和针对性。基因选择的前提有两个:一是高覆盖率、高密度的分子标记遗传图谱；二是校准该图谱上待选的基因和数量性状位点。以下三个例子说明了基因选择在种质资源改良和创新中的应用。
(1)细胞质雄性不育恢复基因
辣椒细胞质雄性不育可以提高杂交制种的效率和纯度，在生产上有广阔的应用前景。CMS的育性恢复受主基因和微基因控制，并受环境条件如温度的影响。恢复系可以在辣椒中找到，但不能在大果形甜椒中找到。在将恢复基因导入大果型甜椒的过程中，需要与不育系杂交以确定恢复基因的存在。研究表明，通过表型选择创造大果型甜椒恢复系是非常困难的。中国农业科学院蔬菜花卉研究所辣椒育种组利用21号牛角椒(rfrf)和湘潭晚椒(rfRf)的F2群体，筛选与主效恢复基因Rf连锁的分子标记(张等，2000)。两个RAPD标记和Rf连锁:OP131400只有0.34cM远离这个主基因；OW19800位于Rf的另一侧，遗传距离为8.12cM。供试的甜椒品种都没有这两个标记，可以利用这两个标记将辣椒的主要育性恢复基因转移到甜椒上。
与法国农业科学院合作，将育性恢复作为一个数量性状定位在多年生()× Yolo Wonder()群体构建的分子标记遗传图谱上(王等，2004)。主恢复基因位于辣椒的6号染色体上，4个微效基因被定位。其中一个微效基因位于2号染色体上，与控制辣味的基因(Pun1)紧密连锁，这解释了为什么辣椒品系的恢复系频率较高。同时发现保持系Yolo Wonder也有能提高育性恢复的微效基因，说明育性恢复具有超亲优势。这些结果对创造高不育性不育系和高恢复性恢复系具有重要的指导意义。
(2)对黄瓜花叶病毒的抗性
CMV是辣椒上最严重的病害之一，可引起严重的花叶症状，叶片变形扭曲，损害果实的商品性。CMV抗性是一个典型的数量性状，到目前为止还没有发现完全抗CMV的材料。然而，在栽培辣椒的野生品系和相关野生种中发现了一些抗性。这些材料对CMV的抗性或耐受性主要有三种机制:①抑制病毒侵入宿主细胞；②抑制病毒繁殖；③抑制病毒的运动。此外，中国的CMV抗源物质中还有另一种CMV耐受机制，第二板斧，即患病后可恢复(Palloix，个人通讯)。通过育种将控制这些抗性机制的基因叠加起来，是获得高抗性品种的必然途径。
Cnta等将抑制多年生植物病毒入侵的QTL定位在3号染色体和12上。8号染色体上的TG66基因座本身不提供抗性，但它与12号染色体上的QTL有上位性相互作用。这三个基因座* * *解释了57%的表型变异(Cnta等，1997)。甜椒自交系Vania能部分抑制病毒的长距离迁移，这种抗性主要由染色体65438上的主QTL-CMV12+02提供。根据表型鉴定的方法，这种QTL解释了45% ~ 63.6%的表型变异(Cnta et al .，2002；Parrella等人，2002年).Palloix等人观察到，Vania抵抗病毒入侵的能力较低，但抑制病毒运动的能力较高；另一方面，常年。育种结果表明，结合这两个抗病机制不同的QTL的材料具有很大的超亲优势(Palloix，personal communication)。
Ben Chaim等人在染色体11上定位了另一个多年生抗CMV QTL——CMV 11。该QTL与TMV抗性基因L连锁，但处于排斥期，说明CMV抗性和TMV易感性常年相关。在多年生植物中，3、4和8号染色体上CMV抗性的QTL与控制果实重量的QTL连锁，即FW 3.2、fw4.1和fw8.1。这样，在回交过程中，多年生小果重QTL将与CMV抗性的QTL一起导入轮回亲本中(Ben Chaim et al .，2001)。为了打破这种连锁负担，必须使用分子标记来准确定位这些紧密连锁的QTL，并在更大的回交群体中筛选重组植物。
(3)对流行病的抵抗力
疫病是辣椒最严重的土传病害。目前国际辣椒育种界公认的抗病性最强的材料是来自墨西哥的小果形地方品种Criollo de Morelos 334(CM334)。法国农业科学院的Palloix小组对这个抗源进行了详细的研究，并鉴定出6个QTL:phyto . 4.1，Phyto.5.1，Phyto.5.2，Phyto.6.1，phyto . 1.66664866。2066其中，Phyto.5.1和Phyto.5.2也存在于多年生和H3等其他辣椒品系中。现在可以通过紧密连锁的PCR标记D04来选择植物5.2(Quirin等人，2005)。
CM334已被各国育种研究机构和种子公司广泛用于提高抗病种质资源或商业化育种。Thabuis等(2004)利用分子标记比较了不同轮回育种方案将抗病性转移到CM334的效率，发现在高选择压力下，抗病性QTL不易丢失。经过多年的努力，Palloix团队培育出了抗疫病能力强的优良甜椒品种(个人通讯)。这些材料的引进为迅速提高我国抗病育种水平提供了机会。
经过“七五”至“九五”的快速发展，我国辣椒育种正面临新的瓶颈。这主要是因为辣椒种质资源的收集、鉴定、改良和创新力度不够，导致育种研究没有取得成功。由于转基因辣椒的困难，分子标记辅助育种已成为提高育种效率的重要生物技术手段。然而，除了细胞质雄性不育的恢复，分子标记技术在我国辣椒遗传研究中尚未发挥作用。为了加强分子标记技术在辣椒育种和种质资源利用方面的研究，人们还有很多基础工作要做，包括通过分子标记建立中国辣椒核心种质资源库，建立分子标记遗传图谱，研究重要性状的分子遗传机理，以及分子标记辅助育种的实际应用。这些工作的实施需要借鉴美国、法国、以色列等国家的先进研究成果，密切关注番茄、马铃薯、烟草等其他茄科作物基因组学的最新进展，需要国内辣椒种质资源研究、分子生物学研究和育种研究单位的通力合作和建立可享受的创新研究体系。