全基因合成方法
全基因合成技术已经非常成熟，一般的做法是设计合成重叠的单链寡核苷酸，通过重叠延伸PCR拼接全长。网上有很多关于全基因合成方法的信息，单个全基因合成相关的专利就有上百个。常见的有重叠延伸PCR(OE-PCR)，双重不对称PCR(DA-PCR) [2]，聚合酶链式反应(PCR) [3]，连接酶链式反应(LCR) [4]，从内到外热力学平衡(TBIO)。说实话，这些方法我都没仔细研究过。它们叫什么名字并不重要，永远都是一样的:PCR，基于某些重叠的短引物，通过聚合酶逐渐延伸生长片段。
合成全基因最简单的方法是什么？
当然让DNA合成公司合成。我们只需要提供DNA序列信息。他们会合成dsDNA并克隆到通用载体上，一般会提供测序信息以保证合成的正确性。这无疑是最简单方便的方法。而且现在整个基因合成很便宜，1bp用测序不到一美元。
既然DNA合成公司这么方便，为什么还要自己合成呢？
①公司合成慢，一般需要1-2周。如果遇到特殊序列，比如对大肠杆菌毒性极大的编码序列，周期就不好说了(我做了一个核酸酶，合成公司一个月没做出来，我自己一个星期就搞定了)。
②不自由。通常，携带目的基因的重组载体由合成公司提供。获得后，需要用酶切割。如果基因含有酶切位点，就需要避免。当然这些一般都不是什么大问题，但是你真的没有办法。
(3)如上所述，全基因合成一般用于异源基因表达，异源表达的对象大多是酶，可能需要构建大量的突变体来研究酶的性质。合成公司只提供了一个序列，突变体还得通过设计引物来重构。如果全基因自行合成，通过替换含有突变的引物，可以同时获得各种突变体，在构建含有大量突变的突变体时更有优势。
序列需要保密，毕竟你是最可靠的。
总有人喜欢自己丰衣足食。在本文中，我要介绍自我综合的方法，并介绍两种方法:
基于“桥接”PCR的1一次性拼接方法
这种方法依靠引物之间的相互退火，相互延伸作为模板，所以需要的引物总是一正一负。首先将整个基因序列打断成短寡核苷酸，一般不超过59bp，因为一般引物合成都是以59bp为分水岭，超过59bp价格和时间成本会高很多。寡核苷酸与3’端的互补序列退火，形成有缺口的双链产物，然后缺口被DNA聚合酶补充，形成有缺口的DNA双链产物。该产物通过Taq DNA连接酶连接，形成完整的双链产物，可以作为模板进行PCR扩增，获得目的基因，也可以将带有缺口的DNA双链直接作为模板进行PCR扩增。
2基于逐步扩展的逐步方法
在这种方法中，只有最后一个引物是反向的，其他的都是正向的，并且正向引物之间有重叠的序列。倒数第二寡核苷酸和倒数第二寡核苷酸通过末端互补序列相互退火。在第一个PCR循环后，双链被延伸，延伸的双链和倒数第二个oligo继续退火和延伸，如此等等，直到全长序列被合成。理论上一个PCR循环只能延伸一个引物，n个oliogs至少需要经历n个PCR循环。由于只有一个延伸末端，引物设计比方法1简单，引物数量不需要偶数。
1.设计PCR引物。
可以使用自动设计工具，也可以手动设计，后面会详细介绍。如果是手动设计的，建议用SnapGene(且不说这个软件的强大，要知道网上有很多破解版，不装自己去百度)。复制完整基因序列后，首先调出“Preferences”面板，找到“Primer”选项，将3’端的最短匹配长度和最低Tm分别设置为10bp和40。
因为3’-末端错配对本文的整个基因合成方法非常不利，如果这两个设置太低，很难设计引物，可以适当提高到12bp，45℃。否则只能优化密码子后重新设计。
引物长度预设为59bp，重点是重叠区的设计，一般要根据重叠区的Tm来确定。不同重叠区域之间的Tm平衡非常重要。Tm不超过3℃，建议将Tm设置在55-58℃之间。需要注意的是，对于本文的第一种方法，引物的数量必须是偶数，从序列开始一条一条的，下一条寡核苷酸的起点是前一条重叠区的终点，上面是直的，下面是反的。如果最后一个数字是奇数，应调整最后几个引物的长度，组成一个反向引物。
对于第二种方法，从序列的开始处拉向前的方向，并且所有其余的是反向的，直到结束，或者可以从结束处拉反向的方向，并且其余的是向前的，直到开始。这种方法不关心引物的数量。
通过PCR获得全长产物。
一般需要两轮PCR。第一轮加入少量引物，推荐50uL体系中0.5-1pmol/ oligo和10-15个循环获得全长模板。本轮PCR推荐的DNA聚合酶要同时失去3’-5’和5’-3’核酸外切酶活性，会破坏重叠区域的Tm平衡。第二轮以1uLPCR产物为模板，加入20pmol全长上下游引物，20-25个循环获得目的基因。这一轮PCR要用高保真的DNA聚合酶。
3.克隆入表达载体。
通过同源重组、限制性内切酶连接等方法将目的基因插入载体，转化大肠杆菌或其他宿主感受态细胞，获得单克隆。建议在全基因合成前，必须为克隆/表达载体设计同源臂或限制性位点，并直接添加到全基因序列中，否则应单独设计引物添加同源臂或限制性位点。
4.测序和鉴定
阳性克隆经PCR鉴定并测序。正确的克隆可用于下游表达和纯化。
优化器:/gems，打不开。
GeneDesign [12]:来自基因组研究。论文里的链接是:/tools/104.html，肯定会打开的。这是我自己写的一个工具，包括密码子分析和优化，基因自动转化成寡核苷酸，生成参考实验方案。产生的寡聚物具有均匀的长度，并且重叠区域具有相同的Tm值。Tm计算公式为:Tm = 64+0.41×GC-528/n，具体请参考我的PCR引物设计方法。生成的oligo可以一键复制，格式为oligo+序列号+空格+Tab+序列(5'-3 ')，可以直接导入SnapGene。
我的程序输出的引物可以被SnapGene识别。点击菜单栏中的“引物”工具，点击“从列表中导入引物”选项，选择从剪贴板中导入序列。
可以检查每个引物是否完全覆盖目标序列，引物的“头尾”是否冲突等等。
用GFP作为靶序列进行测试:
①找到NCBI绿色荧光蛋白的序列，粘贴到文本框中。首先，分析密码子偏好性；
大肠杆菌的稀有密码子用红色标记，说明GFP天然基因中有很多稀有密码子，可以先进行密码子优化。
②寡聚物的生成方式有两种。默认为方法1。如果引物具有高相似性，将提示您使用方法2。
点击生成寡核苷酸按钮，会弹出总碱基数的统计信息，然后输出寡核苷酸序列号和序列，同时生成实验方案按钮和复制按钮。一键复制后可以导入到SanpGene分析中。
③基因分析
GFP基因完全覆盖，甚至有引物，引物之间的Tm基本一致(因为程序和SnapGene的Tm算法不一致，在SnapGene上只能看到基本一致。
(4)生成实验方案
一般体外总基因合成一次不超过1000bp。如果一次性合成太长，会增加出错的概率。我推荐800bp分段，程序会根据你输入的序列长度推荐分段数。
希望这个工具可以帮助你完成整个基因合成，我还写了一个辅助载体构建的工具，后面会介绍。
参考
[1] Prodromou，c .和Pearl，L. (1992)递归PCR:全基因合成的新技术。蛋白质工程。, 5, 827–829.
[2]桑德胡，G.S，阿莱夫，R.A .和克莱恩，B.C. (1992)双重不对称PCR:合成基因的一步构建。生物技术，12，14–16。
[3]斯特梅尔，W.P .，克莱姆里，a .，哈，K.D .，布伦南，T.M .和海尼克，H.L. (1995)来自大量寡脱氧核糖核苷酸的基因和完整质粒的单步组装。基因，164，49–53。
[4] Au，L.C .，Yang，F.Y .，Yang，W.J .，Lo，S.H和Kao，C.F. (1998)通过基于的方法进行基因合成:在大肠杆菌中使用合成基因高水平生产瘦素-L54。生物化学。生物物理学。共同决议, 248, 200–203.
[5] Gao，x .，Yo，p .，Keith，a .，T.J .和Harris，T.K. (2003)基于热力学平衡的内-外(TBIO) PCR的基因合成:一种用于高保真组装较长基因序列的引物设计的新方法。核酸研究，31，e143。
[6]熊亚生，姚清辉，彭，李瑞辉，李，陈，范海辉，程，郑志明，李，于(2004)一种简单，快速，高保真，低成本的基于PCR的长基因序列两步DNA合成方法。核酸研究，32，e98。
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[9] Rouillard，J.-M .，Lee，w .，Truan，g .，Gao，x .，Zhou，x .和Gulari，E.(2004) Gene2oligo:用于体外基因合成的寡核苷酸设计。核酸研究，32，w 176–w 180。
[10] Rydzanicz，r .，Zhao，X.S .和Johnson，P.E. (2005)装配PCR oligo maker:一种设计寡脱氧核苷酸的工具，用于构建用于RNA生产的长DNA分子。核酸研究，33，W521–W525。
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