急需求一篇微生物育种的科研论文。

分析了近年来国内几种常见的物理和化学诱变育种方法的原理、特点和成功案例，为微生物诱变育种提供了依据。综述了信息技术在酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素和农药等高产菌株选育中的应用进展。展望了该技术结合离子束技术和空间技术在微生物菌种选育中的应用前景。

关键词:突变；微生物繁殖；申请进度；前景

微生物与酿酒工业、食品工业、生物制品工业等密切相关。它们的菌种质量直接关系到许多工业产品的质量，甚至影响到人们的日常生活质量，因此需要培育优质高产的微生物菌种。微生物育种的目的是引导生物合成的代谢途径向所需方向发展，或促进细胞内基因的重组以优化遗传性状，人为积累一些代谢产物，以获得高产、优质、低耗的所需菌株。诱变育种作为其中一种方法，已被广泛应用。目前，国内微生物育种界仍主要采用常规理化因子等诱变方法。此外，原生质体诱变技术已广泛应用于酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素等菌种的选育，并取得了许多重大成果。

1，诱变育种

1.1物理突变

1.1.1紫外线照射

紫外线照射是一种常用的物理诱变方法，也是诱导微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA中嘌呤和嘧啶的最大吸收峰在260nm，因此260nm的紫外线是最有效的致死剂。紫外线的作用有很多解释，但确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基之间的正常配对，因此可能导致突变甚至死亡[2]。

紫外辐照诱变简单经济，在一般实验室条件下即可实现，正突变概率高。这种方法主要用于酵母菌株的诱变。

1.1.2电离辐射

γ射线是电离生物学中应用最广泛的电离射线之一。它能量高，能产生电离，电离能直接或间接改变DNA的结构。直接影响就是脱氧核糖的碱基可以被氧化，或者脱氧核糖的化学键和糖与磷酸的化学键。其间接作用是水或有机分子能产生自由基，自由基能与细胞内溶质分子发生化学变化，导致DNA缺失和损伤[2]。

除了γ射线，电离辐射还包括X射线、β射线和快中子。电离辐射有一定的局限性，操作要求高，有一定的危险性，通常用于其他诱变剂不能使用的诱变育种过程。

1.1.3离子注入

离子注入是80年代初出现的高新技术。主要用于金属材料的表面改性。从1986开始逐渐用于作物育种，近年来逐渐引入微生物育种[3]。

在离子注入过程中，生物分子吸收能量并引起复杂的物理和化学变化。这些变化的中间产物是各种活性自由基。这些自由基会对其他正常生物分子造成损害，破坏细胞中的染色体突变和DNA链，还会破坏质粒DNA。由于离子注入范围可控，随着微束技术和精确定位技术的发展，定位诱变将成为可能[4]。

用于微生物诱变育种的离子注入在一般实验室条件下难以实现，目前应用相对较少。

1.1.4激光

激光是一种光量子流，也称为光学粒子。激光辐射可以通过光、热、压力和电磁场效应的综合应用，直接或间接地影响生物体，引起染色体畸变效应、酶的激活或失活、细胞分裂和细胞代谢活动的变化。光量子一旦作用于细胞内含物中的任何物质，都可能导致生物有机体的细胞学和遗传学特征的变异。不同种类的激光照射生物有机体表现出不同的细胞学和遗传学变化[5]。

激光作为一种育种方法，具有操作简单、使用安全等优点，近年来在微生物育种方面取得了很多进展。

1.1.5微波

微波辐射是一种低能电磁辐射，在300MHz~300GHz的频率范围内具有很强的生物效应，对生物体有热效应和非热效应。它的热效应意味着它可以导致生物的局部温度升高。从而引起生理和生化反应；非热效应是指微波作用下与温度无关的各种生理生化反应。在这两种效应的共同作用下，生物会产生一系列的突变效应[6]。

因此，微波也被用于农作物育种、动物育种和工业微生物育种等多个领域的诱变育种，并取得了一定的成果。

1.1.6太空育种

太空育种又称太空诱变育种，是利用高空气球、返回式卫星、飞船等航天器将农作物种子、组织、器官或生命个体搭载到太空，利用太空的特殊环境使生物基因发生变异，然后返回地面进行育种、培育新品种、新材料的一种农作物育种新技术。空间环境因素主要包括微重力、空间辐射以及交变磁场、超真空环境等其他诱变因素。这些因素的相互作用导致生物系统中遗传物质的损伤，从而导致突变、染色体畸变、细胞失活、发育异常等生物学现象的发生。

与其他育种方法相比，航天育种是航天技术与微生物育种技术的有机结合，技术含量高、成本高，是单个科研人员或一般科研单位难以实现的。只能结合航天技术，由国家完成。

2.1化学突变

2.1.1烷化剂

烷化剂可以与一个或几个核酸碱基反应，导致DNA复制和遗传变异过程中碱基配对的转变。常用的烷化剂有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等。

甲基磺酸乙酯(EMS)是最常用的烷化剂，其致突变率很高。其诱发的突变多为点突变，具有很强的致癌性和挥发性，5%的硫代硫酸钠可作为终止剂和解毒剂。

N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)是一种超诱变剂，应用广泛，但有一定毒性，操作时应注意。在碱性条件下，NTG会形成重氮甲烷(CH2N2)，这是导致死亡和突变的主要原因。其作用可能是由DNA与CH2N2的烷基化作用引起的[2]。

硫酸二乙酯(DMS)也是常用的，但由于毒性很强，目前很少使用。乙烯亚胺，产量少，很难买到。使用浓度为0.0001%~0.1%，具有高度致癌性，需配缓冲液。

2.1.2碱基类似物

碱基类似物的分子结构与天然碱基相似，可以整合到DNA分子中，导致DNA复制过程中的错配、mRNA转录紊乱、功能蛋白重组和表型改变。这些物质毒性相对较小，但负突变率较高，往往很难得到好的突变体。主要有5-氟尿嘧啶(5- FU)、5-溴尿嘧啶(5- BU)和6-氯嘌呤。程等[25]用5- BU对产色素细菌(分枝杆菌T17- 2- 39)的细胞进行诱变，平均生物量增加了22.5%。

2.1.3无机化合物

致突变作用一般，危险性小。常用氯化锂，白色结晶，使用时配制成0.1%~0.5%溶液，也可直接加入诱变固体培养基中30 min ~ 2天。亚硝酸盐容易分解，所以现在用。常用亚硝酸钠和盐酸制备亚硝酸钠，亚硝酸钠的浓度为0.01~0.1mol/L，使用时可加入相同浓度和体积的盐酸。

2.1.4其他

还原剂盐酸羟胺作用于C使G- C变为A-T，也是常用的，浓度为0.1% ~ 0.5%，作用时间为60 min ~ 2 h。

另外，诱变时，两种或两种以上诱变因子联合使用，或同一诱变因子反复使用，效果更佳。顾等[7]以谷氨酸棒杆菌- 13761为出发菌株，经DMS和反复诱变，获得一株产L-组氨酸菌株。

2、诱变剂

2.1突变体选择

在选择诱变剂时，需要注意诱变剂的特异性，即一种诱变剂或突变处理优先使基因组的某些部分发生突变，而其他部分很少发生突变，如果有的话。虽然诱变剂特异性的分子基础还不太清楚，虽然相关的修复途径肯定对其有影响，但它们之间的关系并不是那么简单，其他因素，包括诱变处理的环境条件，也会影响突变类型。

工业遗传学家很难正确预测改良某个菌株需要什么样的分子突变。因此，为了产生尽可能多类型的突变体，最合适的方法是采用几种互补类型的突变处理。远紫外线无疑是最合适的诱变剂，它似乎能诱发所有已知的损伤类型。也很容易采取有效安全的预防措施。在化学诱变剂中，液体试剂比粉末试剂更容易安全操作。另一个缺点是，它倾向于产生紧密相连的突变簇，尽管这种效应在一些系统中可能是有利的条件。最后，必须认识到某些特定的菌株可能不会被某些诱变剂诱变。当然，这可以很容易地通过测量容易检测的突变体，如抗药性突变体或原营养回复体的突变动力学来验证。[8]

2.2诱变剂的剂量

从随机筛选的最佳效果来看，诱变剂的最佳剂量是在用于筛选的存活群体中获得所需突变体的比例最高，因为这样会使其在效价测定阶段更加省力。

因此，在菌株改良前，为了确定诱变剂的最佳剂量，为诱变增强技术奠定基础，通常明智的做法是在处理不同菌株时，确定不同诱变剂的诱变动力学。高单位突变本身有时无法确定最佳剂量，因为很难检测到这种突变。但如果使用耐药标志物等易于检测的标志物，只要估计方法的局限性，还是可以提供一些有价值的信息。[9]

3.原生质体诱变在工业微生物育种中的应用进展。

3.1在酶制剂菌株选育中的应用

酶制剂是生物机体产生的催化蛋白，是所有代谢过程中的必需元素。利用原生质体诱变技术对酶制剂生产菌株进行诱变，获得了许多高产菌株。

胡洁等人[10]进行了紫外-氯化锂，N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(N-method-N′-硝基-N-硝基胍，Nt。筛选出8株高产中性蛋白酶的突变菌株，最高产酶量是出发菌株的1162倍，为今后的细胞融合和基因组重组提供了优良的候选文库。

3.2抗生素生产菌株选育的应用

抗生素是微生物细胞的次级代谢产物。目前，微生物发酵主要用于生物合成。由于生产菌株的产量受到多步代谢调控的制约，也很难选育出高产菌株。原生质体诱变作为一种诱变技术，已广泛应用于抗生素高产菌株的选育。

朱等[11]对酿酒链霉菌原生质体进行紫外线诱变，获得一株普那霉素产量为1159g/L的高产突变株，比出发菌株提高了10165438。

3.3在氨基酸、生产溶剂和有机酸育种中的应用

氨基酸是蛋白质的基本单位，蛋白质是一种生物功能高分子。广泛应用于食品、饲料、医药、化工、农业等行业，各国都在大力发展氨基酸生产。发酵已成为氨基酸生产的主要方法。因此，选育高产菌株是氨基酸工业发展的重要方向。

生产溶剂和有机酸是微生物的初级代谢产物，原生质体诱变技术在生产溶剂和有机酸产生菌的选育方面也取得了成果。

3.4生物源菌种选育的应用

维生素是一类维持人类和动物生命活动所必需的，但自身不能合成的有机物质，在生长、代谢和发育过程中起着重要的作用。韩等对青霉PT95原生质体进行激光处理，选育出一株菌核生物量和类胡萝卜素含量显著提高的突变菌株L05。突变体菌核产量提高了98.6%，菌核中类胡萝卜素含量提高了28.3%，类胡萝卜素产量提高幅度达到154.0%。

3.5昆虫育种的应用

苏云金芽孢杆菌是一种从自然界筛选出来的细菌微生物杀虫剂，主要用于防治农林害虫。王力宏等[12]采用UV-LiCl复合诱变方法对苏云金芽孢杆菌NU- 2原生质体进行诱变，筛选出的突变体发酵周期由44h缩短到40.3h，晶体蛋白含量提高了10.03%。

4.放眼未来

近年来，随着新的诱变源的出现，原生质体诱变技术的应用也将取得新的进展。离子束作为一种新的诱变源，有其独特的作用机理[13]，使得离子束诱变具有诱变谱广、变异范围大、诱变率高等优点。它的应用也取得了许多重要成果，特别是离子注入选育VC菌株的成功，为我国Vc产业增添了活力。太空中携带的微生物菌种，通过微重力、空间辐射、超真空等综合空间环境因素的改造，可以在短时间内产生罕见的基因突变，从而进行微生物育种，是空间技术育种的重要应用领域。利用空间技术提高某些抗生素的产量和研究酶制剂已有一些可喜的成果。结合离子注入、空间技术和微生物原生质体技术，微生物原生质体诱变技术将有更广阔的应用前景。

5.结论

随着遗传学和分子生物学的快速发展，许多新的复杂技术被应用于菌株育种，如原生质体融合育种技术和基因工程育种技术，但诱变育种技术仍然是提高菌株生产力的重要而有效的手段。它的正突变率比较高，可以获得许多优良的突变体和新的有益基因类型。另一方面，诱变育种具有一定的盲目性和随意性。在实际应用中，研究人员应根据出发菌株和实验室条件等具体情况选择合适的诱变方法。本实验室采用物理因子和化学因子相结合的方法对多种酵母菌株进行复合诱变，均获得了理想的菌株。此外，我们还在尝试使用多种诱变因子进行多次诱变，以获得更理想的菌株。

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