硝酸纤维素膜NC膜的应用技巧
1.蛋白质与膜的结合原理
蛋白质与膜的结合原理，已知的结合力有疏水力\H键\静电力等。确切的结合原理并不清楚，主要靠假说支持。有两个主要假设:
1)先通过静电力结合，再通过H键和疏水作用长时间结合。
2)先通过疏水作用结合，再通过静电作用长时间结合。
两个假说都表明，结合过程分为两步，先结合，后长期结合。由于组合原理的模糊性，该领域的工作在很大程度上依赖于实践经验。
2.膜对粘接的影响
1)膜孔径
有些技术人员倾向于用膜孔径来区分不同的膜，但请注意，这仅限于同一厂家的产品。如果产品是不同厂家的，这种比较是没有意义的。上面已经描述了膜孔径和色谱速度之间的关系。随着膜孔径的减小，膜的实际可用表面积增加，膜结合蛋白的量也增加。用于估计表面积的参数是表面积比(实际可用表面积与所用膜的平坦面积的比率)。
另外，膜的孔径越小，层析速度越小，因此金标复合物通过T线的时间越长，反应越完全。
综合以上两点，得出膜的孔径越小，灵敏度越高的结论。但同时也减慢了运行速度，增加了非特异性结合的机会，即假阳性越高。因此，需要根据测试结果选择适合实际工程的膜，找到合适的平衡点。
2)不同制造商的膜差异
这种差异主要来自两点:
1 & gt；生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源、种类和数量都不一样。同样，这两种物质一般会对膜处理中的性能产生很大的影响。2 & gt治疗过程不一样。
3.生物原料、试剂和缓冲溶液的配方
1)生物原料作为CT线的生物原料，在不同的情况下使用，这里只简单介绍一下。
首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体，主要是因为多克隆抗体有很多不同的表面位点，每个位点与膜的最佳结合条件略有不同，这无疑增加了优化的难度。其次，分子量越高，蛋白质越难与固体物质结合。
2)缓冲溶液
可能大家最关心的是得到一个性能优异的配方，包括缓冲液、封闭液等等。
其实我也不能给你提供一个万能公式的清单。因为不同的反应体系需要不同的配方来支撑，而且不同机构的反应体系也不一样。想抓鱼，先学会钓鱼。为了不误导大家，我只就以下与公式相关的问题提供思路。具体配方请自行探索。
缓冲液的组成一般是PBS(或其他缓冲体系)+活性物质(针对特定问题)+PH调节。查阅了之前的各种资料，个人意见是配方原则简单不复杂，根据自己的需要添加活性物质。很多原来需要添加的活性物质，由于制膜技术的提高，已经不再需要了。
推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2，对各种抗原和抗体有很好的适应性。
活性物质的情况大致列举如下:
少量NACL可降低信号强度，消除假阳性。
有机醇(甲醇、异丙醇等。)润湿薄膜，减少薄膜携带的静电，有利于结合和镀膜。个人不建议，因为制片工艺的提高。
表面活性剂(TW20，TX100)可以增加亲水力，避免空心线现象，增加颜色。
糖，保护剂，可以减缓老化速度，也可以增加亲水性。
调节PH值到一定的位置，可以消除假阳。
4.样本环境
环境湿度对薄膜沉积过程非常重要。最佳湿度一般为45-65%。湿度过低时，薄膜上容易积累静电荷，薄膜上容易出现散斑，导致测试中出现疏水斑。湿度过高时，薄膜上的毛细作用加强，点状薄膜容易造成CT线变宽甚至扩散。为了保证采样时膜湿度的均匀性，采样前一般将膜放置在这种湿度条件下一段时间。
5.取样仪器与膜表面状况的关系。
目前采样方式有两种，即刮膜式和非接触点膜式。非接触点膜式优于刮膜式，进口刮膜式优于国产刮膜式。
因为刮膜法是用软管刮去膜表面的抗体，而膜本身的物理性质又软又脆，刮管会在其表面留下痕迹。进口的刮膜机使用了更好的材料和控制系统，所以留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留下的划痕更严重。划痕容易对层析金标复合物形成抗性，导致假阳性。同时也容易出现奇怪的现象，如果跑步时T线位置有一条细线(鬼线)，跑完之后鬼线就消失了。
6.胶片的宽度和光点位置
膜的宽度一般为18mm(或20mm)和25mm，分别用于制作试纸和测试板。但是不同的T线采样位置会带来不同的灵敏度。当斑点位置上移时，金标化合物通过T线位置的速度变慢，反应时间增加，灵敏度提高。反之，灵敏度降低。该方法可用于改变灵敏度和消除假阳性。
7.溶液在膜上的扩散
一般来说，膜上的溶液量为1毫升/厘米。膜上溶液的扩散趋向两端，喷洒出均匀的抗体溶液。但干燥时，线边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会继续向两边扩散，所以干燥后抗体会聚集在线的两端。一般情况下，不会影响你的实验。如果你发现线的两端是红色的，中间是浅色的，你就要考虑这个问题了。可以通过如上所述添加作用物质来解决。
8.贴膜前后的密封效果
从供应商处购买的胶片基本都是经过优化的，可以直接使用。但是，我们经常会遇到关于封闭的讨论。其实封闭并不像大家想的那样。一旦关闭，一切都将迎刃而解。老问题走了，新问题又来了，更麻烦了。我想说的是慎用闭包。我是极其反对在定片前封片的做法的。原因是厂家生产膜的时候，各种配方都是和原浆混合的。但密封前需要将薄膜浸泡在密封液中，这必然会扰乱薄膜中正常的物质分布。这就造成了很多问题，降低了工作效率。也有厂家不封口盖不了膜的。其实可以用其他方法解决，密封必然是下一个考验。
我经常使用的密封方法有两种:流动密封和处理样品垫上的活性物质。将膜定点密封，将作用物质制成溶液，喷洒在膜的特定位置。这种方法需要使用BIODOT的AIRJET喷嘴，可以使不合格的半成品板材复活。只要在膜上做了密封，必然会影响产品的稳定性，具体影响程度要通过稳定性试验来判断。
9.膜的储存
新生产的膜通常含有5-10%的水分。膜的老化机制有理论支持，但有争议。理论上，膜的老化是由于膜上的水分蒸发，使膜疏水、带电、易碎。储物膜一般要求避光、密封、不可过干或过湿。在这种保存条件下，一般可以保存两年。但如果膜是密封的，要根据具体的测试情况来判断。由于生产工艺的问题，有些膜在使用后的一段时间内，其灵敏度会发生变化。如果出现这种问题，需要将膜放置一段时间后，待稳定后再投入试生产。
硝酸纤维素滤膜
规格:15X20cm
孔径:0.45μm
储存:密封于5-65438±05℃，保质期一年。
产品说明:本产品外观为白色，膜正面有光泽。遇水应立即浸泡。如果不能立即浸泡，则视为不活动。如果不能取样，薄膜表面有斑点或粉状结构，则视为不良。对于转移电泳，孔径应在0.22或0.45，这样才能保证膜的强度，减少渗透损失。硝酸纤维素膜在过度干燥时易碎，但在潮湿时有弹性。操作时，室内应保持常温，避免过度干燥，防止脆化。本品静电吸附膜亲水性好，渗滤时间适中，蛋白吸附力强，转移膜蛋白浓缩不扩散，显色灵敏度和特异性高，背景低。