融合标签指南
纯化标签是一种已知的蛋白质，或者肽段，可以融合到你感兴趣的蛋白质中。因为这些标签很容易识别，有很多抗体可以选择，非常容易检测。标记的方法主要是重组DNA，即将携带你感兴趣的蛋白质的编码DNA与标记整合，将质粒转入细胞内。当质粒表达后，融合标签将连接到你的蛋白质上。
融合标签的选择很重要，接头序列的选择也很重要。接头序列将你的蛋白质连接到标签上，以确保蛋白质能够正确折叠并具有正常功能。
为什么要使用融合标签？
优势:
(1)分离的蛋白质，即使没有针对该蛋白质的特异性抗体。
(2)纯化后，必要时需要切掉融合标签。
(3)可以将多个标记附着到同一蛋白质上用于多种目的。
(4)避免免疫沉淀过程中的抗体干扰。
(5)荧光标记可用于观察活细胞中的蛋白质。
缺点:
(1)有些标签会影响蛋白质的功能。
(2)需要优化标签位置。
本文只介绍各种标签，并不能说哪种标签一定要放在哪个位置，完全取决于你的实验需求。
如果你不确定你的标签在哪里更好，你需要尝试几种方案，比如改变或添加一个蛋白酶位点，修改接头序列，或者为不同的目的添加多个标签。
目前，有三种主要类型的融合标签:
表位标签:一般为短肽序列，可用于免疫技术应用，如WB、Co-IP。
亲和标签:一般为长型，可用于蛋白质纯化或增加蛋白质的溶解度。
荧光标记:可用于活细胞/死细胞，一般用于成像实验，如细胞定位和* * *表达实验。
这完全取决于你想研究的蛋白质:蛋白质是如何折叠的？哪一端是功能性的？比如C端折叠在蛋白质内部，你就检测不到融合标签的信号；或者翻译后你的蛋白质会在一端被切掉，那么你的标签也会被切掉。
如果不知道自己的蛋白质是怎么折叠的，第一次做的时候最好C端和N端都试试。据报道，C-末端融合蛋白比N-末端标记的融合蛋白更定位于预期的细胞区域。但事实并非完全如此。
并非所有的标签都是一样的:每个标签都有自己的用途和局限性。例如，你需要使你的蛋白质更易溶解，并使用标签来纯化它。串联亲和纯化(TAP)。TAP最初是指将一系列特定的结构域融合成蛋白质:金黄色葡萄球菌的钙调素结合肽(CBP)和蛋白A(ProtA)，它们被烟草蚀刻病毒(TEV)的切割位点分开。然而，这种技术现在可以用于将2-3个融合标签融合到蛋白质上，但通常它仍然包含TAP原始成分。这些标签可以融合到蛋白质的一端或两端。如果标签在使用后需要切断，通常建议将标签串联起来。
他的标签在TAP中被广泛使用，因为它非常小，对于净化实验非常有效。通常与麦芽糖结合蛋白(MBP)一起使用以增加溶解度。另一种常用的组合是GFP和His。
TAP标签虽然有很多优点，但是体积非常大，可能会破坏蛋白质的功能。此外，如果您使用含有CBP的标签，它可能会干扰钙信号。所以，在你的蛋白质上贴尽可能少的标签。
有些小标签对蛋白质的功能影响不大，但有些大标签可能会有意想不到的效果。在这种情况下，你通常需要在测试完标签后将它剪掉。这需要使用特定位点的蛋白酶或肽。
位点特异性蛋白酶理论上不会影响你的蛋白质功能。然而，蛋白酶通常在切割后被去除。一种解决方案是将蛋白酶与标签融合，并通过亲和层析将其去除。几个蛋白酶识别位点的选择取决于你的需求。需要注意的一点是，融合标签是在N端还是C端？从N端切掉标签会留下更少的残基，而从C端切掉标签会在你的蛋白质上留下4-6个以上的残基。以下是几种常用的蛋白酶位点列表(英文版，如有需要请自行查看):
亲和标签如此命名是因为它们经常用于亲和纯化。亲和纯化是一种从细胞裂解物中纯化蛋白质的技术。见下图:
GST是由211个氨基酸组成的蛋白质，分子大小约为26KD。天然GST可以保护细胞免受有害成分和氧化应激。GST的特点是对三肽和谷胱甘肽有亲和力，可用于亲和层析。当含有GST的溶液通过固定有谷胱甘肽的柱时，GST与谷胱甘肽结合并从溶液中分离。结合后可用10mM谷胱甘肽洗脱。
注意事项:
(1)污染:热休克蛋白有时会被GST洗脱。你可以通过SDS-PAGE胶看到这种污染。为了去除热休克蛋白的污染，可以在纯化前用5mM氯化钙和5mM ATP处理细胞裂解液。
(2)蛋白质功能丧失:由于GST是一个大标签，通常以二聚体的形式存在于溶液中。它可能会降低你的蛋白质活性和功能。可以使用蛋白酶(例如凝血酶、因子Xa或前切割)切割。
PolyHis标签因其体积小、结合稳定而被广泛用于蛋白质纯化。虽然His标签可以有2-10个组氨酸残基，但最常用的是6×His标签，或hexatag。组氨酸与固定的过渡金属离子形成配位键，可用于蛋白质纯化。钴和锌柱可用于固定金属亲和色谱(IMAC)，但通常使用镍柱。因为His标签是短肽序列，标签的最佳位置取决于蛋白质特异性，并且它们很少影响融合蛋白的性质。
注意事项:
(1)内源性His: His残基广泛存在于哺乳动物和昆虫中，因此有很高的背景信号。用5-10mM咪唑洗涤可以避免背景结合，但这会过早地洗掉你的蛋白质。另外，用His抗体检测时也要注意背景结合。
(2)不建议将带有金属中心的蛋白质融合到His-tag上，因为金属可能会被亲和树脂吸附。
(3)应避免还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇，因为它们会降低树脂的亲和力。
生物素又称维生素H，是一种分子量为244Da的小分子。它通常附着在二抗上，作为ELISA和WB的可视化技术。生物素能与链霉亲和素和亲和素分子形成非常强的结合，可用于亲和纯化。因为生物素是小分子，不会影响蛋白质的功能。另一个有价值的标签是链球菌标签。因为它的长度是8个氨基酸(WRHPQFGG)，所以不会影响蛋白质的功能，而且在同一个口袋里与生物素可逆结合。这意味着与Strep-tag融合的蛋白质可以通过使用strptavidin树脂有效地纯化，并在温和的缓冲条件下用生物素洗脱。
注意事项:
(1)四聚体和单体的亲和树脂:生物素包被柱可用于纯化生物素标记的蛋白，蛋白可以四聚体或单体形式使用。四聚体abidin色谱柱的洗脱过程需要强变性剂，如尿素或盐酸胍，而单体树脂用10mM生物素缓冲液即可温和洗脱。
(2)哺乳动物系统包含至少四种生物素化的蛋白质，其将用感兴趣的蛋白质洗脱。然而，在大肠杆菌系统中很少遇到非特异性结合。
表位是抗原的一部分，被抗体识别。因此，表位标签通常用于基于抗体的分析实验。表位标签一般比亲和标签短，所以很少影响蛋白质的功能。尽管它们也可用于亲和纯化，但基于免疫抗体的柱价格昂贵，且不如亲和标签有效。而表位标签在检测上有很大的优势。广泛用于细胞培养和免疫沉淀。
人c-myc在增殖细胞中表达水平低，在人类肿瘤发生中起重要作用。c-myc标签来源于C-myc基因的C端，可被抗体有效识别。因此广泛应用于蛋白质检测，如WB、免疫沉淀、流式细胞仪等。
注意事项:
(1)融合入分泌信号:c-myc标签虽然可以放在蛋白质的N端或C端，但不建议融合入分泌信号通路，会影响分泌信号通路的定位。
(2)亲和纯化:虽然也可用于蛋白质纯化，但很少使用。是因为洗脱需要在很低的pH值下进行，会影响蛋白质的功能。
人流感病毒血凝素(HA)标签来源于HA糖蛋白，存在于流感病毒表面，负责病毒的传染性。由于HA是小肽标签，基本不会影响蛋白质的功能，可用于蛋白质检测，如ELISA、WB、免疫沉淀等。抗HA抗体也可用于蛋白质纯化。
注意事项:
亲和纯化:不推荐HA标签标记凋亡细胞中的蛋白质。HA标签会被caspase 3和caspase 7切割，导致免疫反应性下降。
DDDK或FLAG是唯一的专利标签(sigma)，比其他表位标签更亲水。如果需要，包含在DDDK标签中的肠激酶切割序列可以将标签从融合蛋白上切割下来。
注意事项:
亲和纯化:虽然抗DDDK抗体也能有效地纯化蛋白质，但通常比其他色谱柱贵。
V5标签来源于副粘病毒猿猴病毒中的P蛋白和V蛋白。V5标签有两种大小，9-14个氨基酸。但是比较长的常用。有时V5标签与His-标签结合使用。
需要注意的是:
交叉反应:如果使用哺乳动物表达系统，可能会发生交叉反应。
从1992开始，GFP基因被克隆，目前有很多荧光标签可用。荧光标记最大的优点之一就是无毒，所以可以用在活细胞中。虽然荧光标签很大，但对大部分蛋白质功能影响不大。
虽然GFP是一种大小为26.9KD的荧光标记，但也有许多其他标记可用。
如果你打算使用多种荧光标记，选择不同的激发和发射峰是非常重要的。如果发射峰重叠，则很难区分这两种荧光。
通常，您希望使用可用光谱中最亮的荧光标记来标记蛋白质，这样可以获得清晰的信号，并克服任何潜在的背景荧光。亮度值是蛋白质的消光系数和量子产率的乘积。然而，获得的数字可能难以解释。因此，一种常见的测量方法是将荧光标签的亮度与标准标签(如EGFP)进行比较。
成熟定义了荧光标记正确折叠、形成发色团并开始发射荧光的时间。在活细胞的时间敏感事件中，短的成熟时间非常重要。比如SfGFP，10分钟就可以折叠，而mOrange一般需要4个小时。
漂白是光稳定性的一种量度。即发色团被激发后多久失去发光能力。如果你准备做长时间延迟实验，那么考虑一个光稳定性高的标签。T-蓝宝石的漂白半衰期为25秒，而EGFP则稳定得多，一般为174秒。
像大多数蛋白质一样，荧光标记受ph值、温度和氧气水平的影响。根据您使用的条件，您可能需要选择正确的标签。
pH值会影响激发和发射峰，大多数荧光标记对酸敏感。有些甚至可以在pH值变化时改变荧光强度(例如pHTomato)。PKa值是pH敏感性的良好指标。
此外，温度和氧气水平都会影响成熟时间。缺氧通常会延迟成熟时间。然而，新的荧光标记UnaG即使在低氧水平的条件下也能发出荧光。
由于大多数荧光标记来自水母或珊瑚蛋白，而不是哺乳动物细胞或组织，因此可能使用的氨基酸密码子存在物种差异，这可能导致表达水平低和信号弱。
幸运的是，许多新版本的荧光标签已经针对哺乳动物的高表达进行了密码子优化。所以在使用之前，你需要确认你的序列是否能在目标系统中表达。
还有一个很重要的点就是确定你的标签是单体还是二聚体(单体通常用“m”表示，比如mCherry)。这会影响你的实验。很多早期的荧光标记很容易形成寡聚体，可能会影响你融合蛋白的功能。例如，EGFP是一种单体标签，但在高浓度下，它可以形成二聚体，可以破坏亚细胞器或破坏FRET等实验。