植酸酶编码基因的克隆

目前对木霉植酸酶基因的研究很少。到目前为止，GenBank中仅发表了AJ543399(2003)和专利US 7510831 (2009)。罗等(2011)利用GenBank公布的植酸酶A编码序列设计的引物，通过PCR扩增了T2侧耳木霉-1的基因组DNA，获得了长度约为1.7 kb的特异DNA片段。测序结果表明，该DNA片段包含植酸酶编码基因的完整序列和3个内含子序列，其中植酸酶基因为1443 bp，编码480个氨基酸，5’端有一个信号肽序列编码23个氨基酸，其余457个氨基酸残基为成熟植酸酶的氨基酸序列。预测了该基因编码的氨基酸序列的三级结构，发现是磷酸单酯酶。

Juck Zhang等(2012)在含植酸钙的琼脂培养基上鉴定了148木霉菌株产植酸酶的能力，所有受试木霉菌株均具有植酸酶活性，证实植酸酶编码基因在木霉菌群体中广泛存在。从14种木霉中筛选出21株，根据植酸酶保守序列设计简并引物P8205。用P500-2扩增来自17菌株的木霉11菌株的植酸酶基因片段，并测定序列。测序结果显示其大小约为1100 bp，通过序列比对发现，除活性位点外，C端基序附近存在一个约500 bp的保守序列，而其他区域差异明显，说明木霉植酸酶基因序列呈现多样性的特点。

木霉植酸酶基因表现出多样性的特点。木霉菌种间植酸酶基因相似性较高，但木霉菌种间差异明显，系统发育关系与其基因序列基本一致。将获得的植酸酶基因序列与里氏木霉植酸酶基因的专利序列(专利US 7510831)进行比较，发现两者同源性很低，在该基因中没有发现组氨酸植酸酶活性位点。因此，推测不同种里氏木霉产生的植酸酶可能不都属于同一种植酸酶，而本实验仅获得14个木霉菌株。同时，鉴于木霉植酸酶基因多样性分析作为系统发育标记的潜力(Juck Zhang等，2012)(图10.13)。

表10.13木霉菌株植酸酶基因扩增