关于基因测序的一些问题！

DNA测序可分为人工测序和自动测序。手工测序包括桑格双脱氧链终止法和无极生组合-吉尔伯特化学降解法。自动化测序实际上已经成为DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司生产了373、377、310、3700和3100 DNA测序仪，其中310是临床检验实验室应用最广泛的型号。本实验介绍了ABI PRISM 310 DNA测序仪的测序原理和操作规程。

原理ABI PRISM 310基因分析仪(即DNA测序仪)采用毛细管电泳技术代替传统的聚丙烯酰胺平板电泳，并使用公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止子法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物是3’端带有四种不同荧光染料的单链DNA混合物，相差1个碱基，这样四种荧光染料的测序PCR产物就可以在毛细管中电泳，避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序效率由于分子大小不同，毛细管电泳中的淌度也不同。当分子通过毛细管读数窗时，激光检测器窗口中的CCD(电荷耦合器件)摄像检测器可以逐个检测荧光分子。激发的荧光被光栅分割，以区分代表不同基底信息的不同颜色的荧光，图像在CCD相机上同步。分析软件可以自动将不同的荧光转换成DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果可以以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图谱或碱基排列顺序等多种形式输出。

它是一种用计算机自动控制，如自动灌胶、自动取样、自动数据采集和分析，测量DNA片段碱基序列、大小和定量的高级精密仪器。PE还提供凝胶聚合物，包括DNA测序凝胶(POP 6)和GeneScan凝胶(POP 4)。这些凝胶颗粒的孔径大小均一，避免了凝胶制备条件不一致对测序准确性的影响。主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳配件组成。计算机包括用于数据收集、分析和仪器操作的软件。它采用最新的CCD摄像检测器，将DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10 ~ 40分钟。

由于仪器具有DNA测序、PCR片段大小分析和定量分析的功能，可以进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析。除了常规的DNA测序，它还可以进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型和法医学。

试剂和设备

1的主试剂。Big Dye测序反应试剂盒为BigDye Mix，内含四色荧光标记的ddNTP和PE专利的普通dNTP、AmpliTaq DNA聚合酶FS、反应缓冲液等。

2.PGEM-3ZF (+)双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。

3.M13 (-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，为试剂盒的试剂。

4.DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA。模板浓度要调整，PCR反应取1μl为宜。本实验测定的质粒DNA浓度为0.2g/L，即200 ng/μ L..

5.引物需要根据待测DNA片段设计正向或反向引物，配制3.2μmol/L，即3.2 pmol/μ L..如果重组质粒含有通用引物序列，也可以使用通用引物，如M13(-21)引物和T7引物。

6.去离子水或三重蒸馏水消毒。

7.0.2ml或分离自0.5ml PCR管盖，PE公司产品。

8.3 mol/L乙酸钠(pH5.2)称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，用冰醋酸调节pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后包装。

9.70%乙醇和无水乙醇。

10.通过混合37.5毫升无水乙醇和2.5毫升3摩尔/升醋酸钠，NaAc乙醇混合物可在室温下储存65438±0年。

11.pop6测序凝胶ABI产品。

12.模板抑制剂(TSR) ABI产品