有人能详细说说整个基因组测序过程吗？

直接测序是基于MSP进一步研究CpG岛甲基化的方法。亚硫酸盐使DNA中未甲基化的胞嘧啶脱酰胺化，变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。PCR扩增后(引物设计中尽可能避免CpG，以免受甲基化因素影响)，尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序。与未处理的序列相比，可以判断CpG位点是否甲基化。该方法是一种高度可靠和准确的方法，可以明确目的片段中每个CpG位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键CpG站点方面有着无可比拟的优势。测序法以CpG岛两侧无CpG点的一段序列为引物配对区。因此，甲基化和未甲基化的靶序列可以同时扩增。它的缺点是费时费钱。为了获得可靠的数据，至少需要对10个克隆进行测序。需要大量克隆和质粒提取测序，过程繁琐且昂贵。

第一部分是基因组DNA的提取。

这一步毫无悬念。你可以买一套细胞或组织的DNA提取工具。如果实验室条件成熟，可以自己提取。DNA相对稳定。只要手术中不使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

这一步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA和蛋白质的污染非常重要，所以在提取过程中要使用蛋白酶K和RNase来去除。

使用两者的详细信息:

1:蛋白酶K可用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；

2.RNase必须配制成不含DNase的RNase，即市面上购买RNase后，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有2:RNA，DNA也被消化。两者都保存在-20℃下。

有两种方法可以验证提取的DNA的纯度:

1:紫外分光光度计计算OD比值；

2: 1%-1.5%琼脂糖凝胶电泳。

我更喜欢第二种方法，它可以完全明确提出的基因组DNA的纯度，并根据标记的样本大小估计其浓度，以便进行下一次修改。

第二部分是亚硫酸氢钠对基因组DNA的修饰

除非另有说明，所有的DDW都用高压蒸汽灭菌。

1:将约2微克DNA稀释至50微升；在1.5mlEP管中加入DDW；

2:加入5.5ul新制备的3M NaOH；

3: 42℃水浴30分钟；；

水浴期间的准备工作:

4: 10 mm氢醌，水浴后向混合溶液中加入30ul(溶液变成淡黄色)

5: 3.6m亚硫酸氢钠(适马，S9000)，配制方法:1.88g亚硫酸氢钠用DDW稀释，用3M NaOH滴定至PH 5.0，定容至5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶解，但是加入NaOH后会慢慢溶解，需要耐心。PH值必须正好为5.0。水浴后向上述溶液中加入520微升。

6: EP管用铝箔纸包裹，避光，溶液轻轻倒置。

7:加入200 ul石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8: 50℃黑水浴16h。

一般这一步从下午4点开始，熟练的话不到5点就能完成。16h的水浴是第二天早上8点刚过，非常适合。

此步骤的详细信息:

1:基因组DNA的量不需要非常精确，宁可多也不要少，因为在后续的纯化和回收步骤中会损失掉，这种方法最多可以修改到4ug。

2.所有试剂必须是新鲜配制的，所以配液的技术必须过关，既要快又要准。

3.亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，必须用碱调节PH值至5.0，否则PH值不当会影响后续的净化和吸收。

4.最好的水浴是16小时，虽然可以短到8小时，但是后面的修改会不彻底。

第三部分是修饰DNA的纯化和回收

除非另有规定，否则EP管采用高压灭菌。

1.将移液枪头置于石蜡油层下，先轻轻加压排出一小截石蜡油，再将混合液吸入干净的1.5mlEP管中。

2.下面使用Promega向导清理DNA纯化和回收系统(Promega，A7280)。

1)70℃水浴预热DDW；；制备80%异丙醇；

2)加入1ml Promega的Wizard DNA清理树脂，轻轻倒置混合均匀，使DNA与树脂充分结合；

3)由于试剂盒只配有注射器，没有针塞，如果有真空负压吸引器，使用起来非常方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。注射器筒与试剂盒提供的回收柱紧密连接后，用移液管将上述混合物移入注射器内，柱下放置2ml以上的EP管接收废液。加入针塞，轻轻按压，挤出液体。此时，在柱中可以看到白色树脂沉积物。

4)将注射器与药筒分离后，拔出插销，然后将注射器与药筒连接，在注射器中加入2ml 80%的异丙醇，插入插销，轻轻按压，挤出异丙醇。这是洗涤步骤。

5)将注射器与药筒分离，将药筒放在1.5ml的干净EP管上，以12000 rpm离心2分钟，以除去残留的异丙醇并干燥树脂。此时，修饰的DNA处于与树脂结合的状态。

6)取出色谱柱并将其放在另一个干净的1.5mlEP管上，向移液管中加入50微升预热的DDW，并在室温下放置5分钟。

7)离心12000转20s，这是洗脱步骤。此时，EP管中的液体是最终体积为50ul的洗脱的修饰DNA溶液。

3:加入5.5微升新制备的3M NaOH，并在室温下放置65438±05分钟。

4:添加33ul 10M乙酸铵以中和NaOH，并使溶液的PH值约为7.0。

5.加入4U10 mg/ml糖原作为沉淀指示剂，因为它与乙醇混合后能产生沉淀，便于离心后识别回收物的位置，防止回收物在吸收残留乙醇时被吸走。其实很难说这些糖原能起到多大的作用。不过有国产糖原卖，包装不大，很便宜。买的话要严格按照文献上的步骤来。

6:加入270ul冰无水乙醇，置于-20℃下，静置过夜。有人认为最短的沉降时间可以是2个小时，但我认为可能需要更长的时间。而做这一步的时候，一般会持续到中午。如果样品很多，可能放一夜比较好，所以时间安排可以放宽，顺便做一些其他的实验。如果你想当天完成，没有问题，但是我觉得最好是长时间结算，至少6个小时。

7: 4，12000rpm离心30分钟，倒出上清液，收集沉淀。没必要完全吸收。

8:加入500ul 70% 70%乙醇，不要把沉淀物吹起来，只需加入乙醇即可。轻轻倾斜EP管，旋转一次，再次以4度12000 rpm离心5分钟。离心后，倒掉上清液，加入等量的乙醇，再做一次。这是一个洗的步骤，* * *两次。

9:倒掉上清液，室温下短暂离心后，将贴壁的乙醇分离至EP管底部，用移液管小心吸取残液，室温下干燥5分钟，或当沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul- 30ulDDW溶解沉淀。到目前为止，修饰DNA的纯化和回收已经完成，修饰DNA溶液可以用于进一步的实验。

10:-20℃保存DNA溶液。

此步骤的详细信息:

1:使用注射器时，用力必须均匀、轻。如果使用暴力，柱中的膜将被压碎并失去作用。

2.乙酸铵和糖原不需要新鲜制备。原糖配好后要在-20℃下保存，醋酸铵可以在室温下保存，因为这样浓度的醋酸铵非常不溶。一旦放在4℃，取出时会有很多溶质析出。

3:异丙醇和70%乙醇不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配制方便。

这一步的关键是树脂和DNA的结合，再次强调了第二部分调整亚硫酸钠PH值的重要性。因为树脂和DNA的结合需要一个合适的PH值，如果前一步没有做好，这一步树脂就不能很好的和DNA结合，会带来灾难性的后果，就是DNA和液体一起被挤出来，洗脱的时候其实是没有DNA的。

修饰的DNA的第四部分用于PCR。

这一步毫无悬念。我在这里主要讲几个棘手的问题:

1:引物问题:感觉自己设计引物挺难的。我设计过几对引物，尝试过，但都以失败告终。如果时间足够，相对新的基因文献不多，我自己设计引物是没问题的。如果没有，不如参考文献。先查阅SCI分数高的文献，再查阅著名实验室的文献。国内有就更好了。可以直接联系咨询。找到序列后，一定要与Genbank中的序列进行比对，防止因排印错误造成的个别碱基差异。然后你可以在谷歌上搜一下，看用户多不多，系统条件一样不一样。用户多，系统条件相同，说明重复性比较强。我也是据此行事，比较顺利。

2.Taq酶问题:有文献使用高保真金牌Taq(白金)，但我感觉只要体系正确，变性退火等条件合适，一般的热启动酶还是可以的。我开始用Takara的LA Taq，很好用，配有10x LA缓冲液，含mg++。有时候用完了，可以临时用Takara的普通Taq酶。如何选择？

3.PCR条件:变性一般是95度，3m 3分钟。我感觉剩下的都是根据文献，退火可以根据你的引物退火温度小范围尝试。一般和文献报道差别不大。这只是扩增片段特异性的问题。建议遵循文献。

4.PCR最好选择进口EP管，管壁薄，厚度均匀，能保证温度的快速变化能及时传递到管内的反应液，使系统真正在设定的温度下运行。

5.PCR仪:如果是在某个仪器上做的，最好一直用这个仪器。不同的仪器有不同的火候，但是EP管一定要和仪器里的插孔紧密结合，留有空隙，我觉得会影响温度传递。

这部分有点啰嗦，只是一些不成熟的个人经验。有问题请指出来交流。我今天先来了，现在在写一些内容，比较费力，不能一蹴而就。请原谅我。我休息一下，准备写蓝白点筛选克隆的最后一部分。

第五部分是PCR产物的凝胶回收。

这一步相对简单。可以买凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的，价格合理，比如天根的产品(二手)。请按照说明操作。

一些细节:

1:新配制的电泳液应用于PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。凝胶浓度可以是1%-2%。

2.回收凝胶DNA时，在300nm紫外灯下观察条带位置，将目的片段所在的凝胶切开，尽可能小，保证特异性。

3.紫外线照射时间不宜过长，否则会损伤DNA。

4.回收的DNA如果不马上使用，会保存在-20℃下，几个月内非常稳定。

第六部分是PCR产物与T载体的连接转化和蓝白色斑点的筛选。

1:连接T载体(本实验使用Promega的试剂盒)

15ul系统

T-easy 1ul

连接酶1ul

2x缓冲器7.5ul

DNA 5.5ul微升

4度，一夜之间。

2.连接产物的转化

1)-70度从冰箱中取出感受态细菌，融化后放在冰上；

2)连接产品15ul全部加入，冰30分钟；

3)42度90秒；

4)冰上2分钟；

5)800ul LB培养基；

6)280rpm，37度，摇床45分钟(将试管沥干，摇匀，保证菌液摇匀)；

7)8000转，1分钟；去除超净台中的上清液，留下100-150 ul；

8)包被:37度孵育过夜；(平板是含有氨苄青霉素的固体LB培养基)

第一层:X-gar 35ul

IPTG 25ul

后涂层:悬浮

过夜后，可以在板上看到许多蓝色或白色的斑点。以白点为例，尤其是蓝点周围的白点，自链接率较低。

3.取一些白点，把它们计划在新的板上。

新电路板:首次涂漆:X-gar 35ul

IPTG 25ul

然后在板子底部画一个隔断，并做上标记。根据需要，一块板做50个克隆体一般没问题。

针选择白点并在板上的相应区域标记2条泳道。

37度，保温箱过夜。

4.联系测序公司发送测序。一般一个克隆定位在35-45元。

此部分的详细信息:

1:涂层要均匀，Xgar和IPTG要均匀分布在板面上；

2.不要让蓝白色的斑点长得太满，否则很容易一下子选两个克隆体。