在线引物设计引物——如何用Primer6.0设计引物？
QPCR引物设计+在线验证
方法1: NCBI探针
1.在NCBI之前，有一个直接设计引物的探针选项，这将给出上游和下游序列。例如，搜索小鼠nanog基因，得到如下两个引物:
上游引物:TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT
下游引物:ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT
方法二:Primer3web
参考:Primer3web在线底漆设计——2分钟学会极简主义的底漆设计！-毕丽·毕丽
2.1.寻找基因序列
以人p53为例，设计引物。
PubMed官网:
第一步:下拉选项选择核苷酸。
第二步:输入基因+物种+mRNA(例如p53humanmRNA)。
第三步:点击搜索。
第四步:单击并选择左栏中的(mRNA4.782)。
第五步:点击进入我们要找的p53humanmRNA的第一篇文章(Homosapiens _ mRNA _ for _ p53，完整CDs)。
步骤6:单击选择功能中的CDS选项。
第七步:点击选择FASTA格式，就会出现这个基因的CDS系列。
2.2.开始设计引物。
Primer3web官网:
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进入Primer3web官网后，进行如下操作:
第一步:从下拉项中选择物种(人类)。
第二步:在输入框中输入刚才复制的CDS序列。
第三步:点击选择引物。
步骤4，输出引物序列；最终结果，有四对引物可供选择。
选择合适的底漆:如何合适？
首先要看引物的扩增长度，最好扩增在100~300bp之间；
引物的长度为20~25bp，上下游引物的差异不应超过5bp。
然后看Tm值，60℃左右，差值应该不会超过1℃。
再补充一点:
既然设计了qPCR引物，就必须跨外显子设计，以避免基因组DNA对CT值的影响。如果不跨越外显子，放大溶解曲线的CT值会更小。那么怎么知道自己设计的引物是不是跨外显子设计的呢？
答案是，我们可以将我们设计的引物的基因组位置与NCBI上该基因的外显子和内含子的连接位置进行比较。直接看那个基因的mRNA的连接位置就可以了。
方法3:NCBI-爆炸-引物-爆炸
以上引物设计完成后，人工查找引物是否越过内含子太麻烦。然后普及更方便的方法。
参考:
3.1:在NCBI上找到目标基因的mRNA序列。
打开NCBI主页面，选择基因，输入基因名称--"显示许多不同的同名基因--"找到你想要的物种，打开--"显示基因信息，找到" mRNAandprotein "前面的nm * * * * * * *，复制编号。
注意:这个时候你会看到NM**** *的很多条信息，说明这个基因的不同同工型，可以通过查阅文献和这些基因序列背后的解释来确定。如果不清楚，一般选最长的。
3.2.开始设计跨越外显子的引物。
打开NCBI上的-BLAST-primer-blast网站，将上面复制的mRNA编号输入到序列框中，从下拉选项中选择你的物种，然后从Exonjunctionspan下拉框中选择primerusspananexon-exon junction，设置最小和最大引物长度，然后点击Getprimer。您可以跳转到Primer-blast结果页面。这个过程会有点长，稍微等一下。出来的时候有一栏叫Graphicalviewofprimerpairs，会告诉设计的引物穿过了哪些外显子。
从这些跨越外显子的引物对中选择最佳的一对:
a)一对引物中只有一个引物穿过外显子。(因为一个引物穿过内含子，所以这个引物不会与基因组DNA匹配。即使另一个引物与基因组DNA匹配，一个引物也不会扩增任何东西。因为一个引物的扩增达不到指数增长，几十个循环后，信号就被正确匹配的指数增长的信号掩盖了。就像普通PCR中，只有上游或下游引物，PCR中绝对没有。因为产量太低。)
b)一对引物之间的距离不能太长，因为扩增产物要在100-300bp之间，会影响ct值。
验证自己设计的引物PCR产生什么？可以做个电子PCR看看。
1.UCSC-芯片PCR工具
进入UCSC，选择工具In-SilicoPCR，输入上游和下游引物，选择目标处的genomeassembly，点击提交，或者如果你不能通过这种方式出来，记得检查FlipReversePrimer。因为上游和下游可能是颠倒的。如果提交成功，会出来一个很长的序列，会告诉你这个电子PCR完成后产生的序列的位置和起止长度。然后用NCBI的基因选项输入自己PCR的目的基因，看目的基因的起始位置，就知道PCR是不是目的基因序列了。
注意:OCR产生的序列只能是目标基因的一部分，只需比较序列的起始位置即可。因为引物是用目的基因设计的，所以通过PCR获得两个引物之间的序列。
进入NCBI-BLAST-primerBLAST；或者直接上这个网站:Primerdesigningtool()
在primerparameter中输入您刚刚设计的上游和下游引物。
在数据库下拉选项中选择RefseqmRNA。
再次单击Getprimer
等一下，它会卡一会儿你才出来。
一份详细的初步报告出来了；上面说Productsontargettemplate都是HomosapientumorproteinP 53 (TP53)的不同转录本，产物的长度是一样的。表明该基因被这些引物扩增。
两种验证方法的优缺点:
UCSC验证法可以测试你扩增的所有序列；
NCBI的BLAST只能给出扩增产物是否是你想要的基因以及扩增产物的长度。
选择:建议用NCBI-blast-引物-BLAST法设计引物，也可以用NCBI-BLAST-引物-BLAST法验证你设计的引物。
技术分享qPCR引物设计有妙招-Zhihu()
比如基因Syt4(小鼠)设计的qPCR引物。
步骤1:输入NCBI基因，找到该基因mRNA的NM * * * *号。
第二步:将该号码输入到NCBI-爆炸-起爆器-爆炸输入序列框中，并检查相应的条件；PCR产物的长度限制在70-300；由此，设计了10个跨内含子的引物，并根据Tm条件选择第二对引物:
上游:GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT
下游:CCAACCGTCCAATCACCTCA
第三步:将这对引物重新输入NCBI-BLAST-primer-blast的上下游引物框，点击Getprimers。发现这对引物扩增出的唯一基因是Syt4基因，说明这对引物具有良好的特异性。
第四步:进入UCSC-Tools-In-Silico PCR，输入上游和下游引物，点击提交。如果跳出后没有产品，就回去调整参数，比如target parameter，FlipReversePrimer:是否检查等。最终产物为Syt4，长度为220bp。说明这对引物的PCR产物具有很高的特异性，而且只有一个产物。
第五步:进一步验证:因为引物是设计穿过内含子的，又提醒我上游引物穿过了内含子，所以我输入NCBI-核苷酸，输入:Syt4MusmusculusmRNA，点击搜索，然后点击左栏的mRNA，再点击第一项......参考上面的步骤2.1。寻找这个基因的CDS序列，找到CDS序列后，我们搜索了上下游两个引物，发现都在CDS区域，这些引物的PCR产物序列也都在CDS区域。经过仔细检查，我们发现上游引物位于1203-1224，确实跨越了两个外显子:外显子1098..126544.
以上，我们设计了Syt4基因的qPCR引物序列。可以由公司直接合成。
以上都是qPCR的引物设计。一般情况下，扩增的基因产物仅在100-300bp之间，用于定量或半定量。但是如果你想扩增全长DNA，你需要Primer5软件。扩增产物的长度可以自己设定。
如何使用PrimerPremier5软件设计PCR引物-百度经验()
如何在线设计Primer3？首先要看你设计的底漆是干什么用的。如果用于普通PCR检测或RealtimePCR，复制mRNA序列并选择相应的大小。普通PCR的产物大小原则上控制在250~600bpRealtimePCR和100 ~ 200之间。最好爆破系统给出的引物对，选择跨外显子的引物对。
你不需要太在意引物设计的经典规则，比如末尾GC%的个数。Primer3自己的设计算法很好，及时设计的引物有二聚体发夹结构，绝大多数情况下不会影响使用甚至非常好用。
如果是扩展的固定序列，基本不用用Primer3看GC%，平均没有连续重复序列。这部分是另外一点。
如何用Primer6.0设计引物？1.首先，选择目标基因序列。对格式没有要求，复制目的基因序列即可。
2.在文件目录中打开“新建”,然后选择“序列”。这里的另一个项目选项是导入文件的方式，即将目标基因保存为文件可以直接导入到文件中。复制一般比较方便。
3.打开序列后，会弹出一个粘贴框。只需粘贴刚才复制的基因序列，然后点击下面的添加即可。
4.选择上面带有红色和蓝色箭头的按钮来设计引物。在设计开始之前，您可以更改设计参数，包括搜索的碱基范围、引物长度、碱基数量、设计结果中显示的引物数量等。
5.设置好参数后，点击下方搜索，软件开始分析设计。完成后，单击确定。设计结果将显示如下。
6.在结果中，蓝色为前引物，红色为后引物，Rating为引物的综合评价得分。最上面也会显示引物的优缺点，最好的是最好的，中等的是好的，最差的是差的。一般选用的底漆最好或好，其他显示器不可用。
7.右边有两个选项。AllPrimers可以查看多对可供选择的不同引物。可以根据需要选择具有合适位置和产物长度的引物。选择后，您需要点击下面的替换来替换它。
8.AllStructers可以查看当前所选引物的结构，如发夹结构、引物二聚体和重复碱基。
9.选择好引物后，点击下面的引物序列，然后右键弹出复制信息的选项，然后导出设计好的引物。您也可以将结果直接导出为文件。