抗原抗体杂交

单克隆抗体的制备

1975年，kühler和milstein首先报道了用绵羊红细胞(srbc)免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，建立了第一个B细胞杂交瘤细胞株，并成功制备了抗srbc的单克隆抗体(mcab)。迄今为止，世界上已研制出数千株单克隆抗体。

单克隆抗体理化性质高度统一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于手工处理和质量控制，来源容易，因此一问世就受到欢迎和重视。在医学领域，单克隆抗体在诊断疾病、判断预后、预防和治疗疾病以及研究疾病机制方面发挥着巨大的作用。因此，两位发明家以1984获得了诺贝尔医学奖。

第一节杂交瘤技术的基本原理

杂交瘤抗体技术的基本原理是融合两种细胞，同时保持其主要特性。这两种细胞分别是抗原免疫的小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主要特征是其抗体分泌功能和在选择性培养基中生长的能力(见后面的选择原理)，而小鼠骨髓瘤细胞在培养条件下可以无限分裂增殖，称为永生细胞。在选定培养基的作用下，只有B细胞和骨髓瘤细胞的杂交体才能具有持续增殖的能力，形成兼具抗体分泌功能和细胞永生性的细胞克隆。其原理从以下几个主要步骤来阐述。

(A)细胞选择和融合

杂交瘤技术的建立是为了制备针对抗原的单克隆抗体，所以融合细胞方必须选择抗原免疫的B细胞，通常来自免疫动物的纪念碑细胞。脾脏是B细胞聚集的重要场所。无论何种免疫刺激，脾脏都会有明显的抗体反应。融合细胞的另一面是保持细胞融合后的细胞增殖，只有肿瘤细胞具有这种特性。选择同一系统的细胞可以增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系的恶性肿瘤，所以是脾细胞的理想融合伴侣。目前B细胞瘤常用的株系有P3-x63-ag8(k￠hlerandmilstein，1975)、P3-NSI/1-Ag4-1(k￠hlerandmilstein，1976)、x6。Sp2/0-ag14(舒尔曼塔尔，1978)等。这些细胞系都是hat敏感细胞系。

细胞融合剂的使用对细胞膜造成一定程度的损伤，使细胞容易相互粘连融合在一起。最好的融合效果应该是细胞损伤程度最低，融合频率最高。聚乙二醇(PEG 1000 ~ 2000)是目前最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为40% (w/v)。

(二)选择性培养基的应用

细胞融合是一个随机的物理过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的混合细胞悬液中，融合细胞会以各种形式出现。例如融合的脾细胞和肿瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的肿瘤细胞和肿瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的肿瘤细胞和细胞的聚合物形式。正常脾细胞在培养基中仅存活5 ~ 7天，细胞的多聚体形式未经特殊筛选易死亡。然而，未融合的肿瘤细胞需要特别筛选和去除。

通常有两种方法来合成细胞dna。主要途径是糖和氨基酸合成核苷酸，再合成dna。叶酸作为一种重要的辅酶，参与了这一合成过程。另一个辅助途径是在次黄嘌呤和胸苷存在下，在次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(hgprt)和胸苷激酶(tk)的催化下合成dna。细胞融合的选择性培养基中有三种关键成分:次黄嘌呤(H)、甲氨蝶呤(A)和胸苷(T)，所以这三种成分的前缀称为hat培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，能阻止肿瘤细胞通过正常途径合成dna。用于融合的肿瘤细胞是从毒性培养基中选择的hgprt -细胞株，因此它们不能在该培养基中生长。只有融合的细胞具有双亲的遗传特性，才能在hat培养基中长期存活和繁殖(图11-1)。

(3)有限稀释和抗原特异性选择

在动物免疫中，应选择高纯度的抗原。一个抗原往往有多个决定簇，一个动物受到抗原刺激后产生的体液免疫反应，本质上是许多B细胞群的抗体分泌。然而，只有少数B细胞靶向靶表位。因为细胞融合是一个随机的过程，相当比例的融合细胞需要仔细筛选和去除。筛选过程一般分为两步:一是融合细胞的抗体筛选，二是以此为基础的特异性抗体筛选。将融合后的细胞充分稀释，使分布在培养板每个孔中的细胞数在0 ~几个细胞之间(30%的孔为0，保证每个孔为单个细胞)，培养后取上清液，用elisa筛选抗体分泌高的细胞；这个过程通常被称为克隆。再次克隆这些阳性细胞，通过包被有特异性抗原的elisa找到针对靶抗原的抗体阳性细胞株。增殖后冷冻、体外培养或接种于动物腹腔。