DNA测序仪

不过我想说，目前DNA测序还是依靠桑格原理，只是结合荧光染料提高了灵敏度。

DNA测序的原理和方法

DNA测序可分为人工测序和自动测序。手工测序包括桑格双脱氧链终止法和无极生组合-吉尔伯特化学降解法。自动化测序实际上已经成为DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司生产了373、377、310、3700和3100 DNA测序仪，其中310是临床检验实验室应用最广泛的型号。本实验介绍了ABI PRISM 310 DNA测序仪的测序原理和操作规程。

原理ABI PRISM 310基因分析仪(即DNA测序仪)采用毛细管电泳技术代替传统的聚丙烯酰胺平板电泳，使用公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止子法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物是3 ' ' '端有四种不同荧光染料的单链DNA混合物，相差1个碱基，这样四种荧光染料的测序PCR产物就可以在毛细管中电泳，避免了泳道和之间迁移率差异的影响由于分子大小不同，毛细管电泳中的淌度也不同。当分子通过毛细管读数窗时，激光检测器窗口中的CCD(电荷耦合器件)摄像检测器可以逐个检测荧光分子。激发的荧光被光栅分割，以区分代表不同基底信息的不同颜色的荧光，图像在CCD相机上同步。分析软件可以自动将不同的荧光转换成DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果可以以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图谱或碱基排列顺序等多种形式输出。

它是一种用计算机自动控制，如自动灌胶、自动取样、自动数据采集和分析，测量DNA片段碱基序列、大小和定量的高级精密仪器。PE还提供凝胶聚合物，包括DNA测序凝胶(POP 6)和GeneScan凝胶(POP 4)。这些凝胶颗粒的孔径大小均一，避免了凝胶制备条件不一致对测序准确性的影响。主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳配件组成。计算机包括用于数据收集、分析和仪器操作的软件。它采用最新的CCD摄像检测器，将DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10 ~ 40分钟。

由于仪器具有DNA测序、PCR片段大小分析和定量分析的功能，可以进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析。除了常规的DNA测序，它还可以进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型和法医学。

试剂和设备

1的主试剂。Big Dye测序反应试剂盒为BigDye Mix，内含四色荧光标记的ddNTP和PE专利的普通dNTP、AmpliTaq DNA聚合酶FS、反应缓冲液等。

2.PGEM-3ZF (+)双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。

3.M13 (-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，为试剂盒的试剂。

4.DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA。模板浓度要调整，PCR反应取1μl为宜。本实验测定的质粒DNA浓度为0.2g/L，即200 ng/μ L..

5.引物需要根据待测DNA片段设计正向或反向引物，配制3.2μmol/L，即3.2 pmol/μ L..如果重组质粒含有通用引物序列，也可以使用通用引物，如M13(-21)引物和T7引物。

6.去离子水或三重蒸馏水消毒。

7.0.2ml或分离自0.5ml PCR管盖，PE公司产品。

8.3 mol/L乙酸钠(pH5.2)称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，用冰醋酸调节pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后包装。

9.70%乙醇和无水乙醇。

10.通过混合37.5毫升无水乙醇和2.5毫升3摩尔/升醋酸钠，NaAc乙醇混合物可在室温下储存65438±0年。

11.pop6测序凝胶ABI产品。

12.模板抑制剂(TSR) ABI产品。

13.10×电泳缓冲液ABI产品。

14.ABI Prism310自动DNA测序仪。

15.2400或9600 PCR仪。

16.台式冷冻高速离心机。

17.台式高速离心机或袖珍离心机。

操作程序

1.PCR测序反应

(1)取一个0.2毫升的PCR试管，用记号笔进行编号，将试管插入粒状冰中，并根据下表添加试剂:

用于测量添加了试剂的模板管的标准控制管

BigDye混合物1微升1微升

质粒DNA 1 μ l-

PGEM-3Zf (+)双链DNA-1 μ l

正向引物1 μ l-

M13(-21)引物-1μ l

无菌去离子水2微升2微升

总反应体积5μl，不加轻质矿物油或石蜡油，PCR管盖紧，用手指弹性管混匀，稍离心。

(2)将PCR管放在9600或2400 PCR仪上进行扩增。98℃变性2分钟后，进行PCR循环。PCR循环参数为96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25个循环。扩增后，温度设定为4℃。

2.乙酸钠/乙醇法纯化PCR产物。

(1)离心混合物，并将扩增产物转移至1.5ml EP管中。

(2)加入25μl乙酸钠/乙醇混合溶液，充分摇匀，置于冰上65438±00min沉淀DNA。在4℃下以12000转/分钟离心30分钟，小心弃去上清液。

(3)加入50μl 70%(V/V)的乙醇洗涤沉淀物两次。在4℃下以12 000r/min离心5min，小心弃去管壁上的上清液和液珠，真空干燥沉淀10 ~ 15min。

3.电泳前测序PCR产物的处理。

(1)向离心管中加入12μl TSR，剧烈摇动，让其充分溶解DNA沉淀，轻微离心。

(2)将溶液转移到0.2ml PCR管中，打开盖子，稍微离心。

(3)在PCR仪上进行热变性(95℃2min)，然后在冰中淬灭。

4.按照仪器的操作说明安装毛细管，校正毛细管的位置，手动灌胶，建立测序序列文件。仪器会自动将胶水注入毛细管，65分钟438+0.2kV预电泳5分钟，按编程顺序自动进样，65分钟438+0.2kV预电泳20分钟，7.5kV电泳2小时。电泳结束后，仪器会自动清洗、倒胶、进下一个样品、预电泳和电泳。每个样品的总电泳时间为2.5h，电泳结束后，仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如果测序顺序已知，可以通过序列比对，将不同的碱基标上星号，提高工作效率。

6.测序后，根据仪器的操作规则清洁和维护仪器。

计算

测序反应准确度的计算公式为:100%-差异碱基数(不含N数)/650×100%。

差异碱基是指确定的DNA序列与已知的标准DNA序列不同的碱基，N是仪器无法读取的碱基。

注意事项和评价

1.ABI prism 310基因分析仪是一种高档精密仪器，需要专人操作、管理和维护。

2.本实验测序PCR反应总体积为5μl，并且没有用矿物油覆盖，因此PCR管盖的密封非常重要。除了加完试剂后关闭PCR管盖，最好使用PE公司的PCR管。如果PCR后PCR液少于4 ~ 4.5 μ l，则PCR反应可能失败，无需纯化和上样。

3.作为测序用户，他们只需要提供纯化的DNA样本和引物。在测序PCR反应中使用不同的模板，因此所需的DNA量是不同的。PCR测序需要的模板量少，一般PCR产物需要30-90 ng，单链DNA需要50-100 ng，双链DNA需要200-500 ng，DNA纯度一般为A 260 nm/a，以去离子水或蒸馏水为引物配制3.2 pmol/μ L为好。

4.本实验使用的测序试剂盒为BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测量的DNA长度约为650bp。本仪器DNA测序的准确率为(98.5±0.5)%，本仪器无法读取的碱基数小于2%。如果待测长度超过650bp，则需要设计另一个引物。为了保证测序更准确，可以设计反向引物对同一模板进行测序，并相互验证。n碱基可以手动检查，有时可以读出。为了提高测序的准确性，根据星号表示的位置，可以人工分析彩色图谱，进一步检查碱基。