组织培养的方法和程序有哪些？

外植体的选择(1)一般来说，组织培养中的外植体可分为两类:一类是带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等。，可在组织培养过程中直接诱导和促进丛生芽的产生，获得再生植株的成功率高，变异性小，易于保持材料的优良性状。另一类主要是根、叶等营养器官和花药、花瓣、花托、胚珠、果实等生殖器官。这些外植体大多需要一个脱分化过程，在愈伤组织阶段后分化成芽或胚状体，然后形成再生植株。

在快速繁殖中，最常用的外植体是茎尖。通常切口在0.5 cm左右，太小，产生愈伤组织的能力弱；如果太大，它会在培养容器中占据太多的空间。如果用外植体培养脱毒苗，通常只取茎尖的分生组织部分，其长度通常在0.1 mm以下。

(2)外植体的消毒由于大部分外植体使用的是从外部生长的植物，所以往往会携带各种微生物。如果把它们带入培养基中，它们会迅速繁殖，形成污染，导致培养失败。因此，外植体的消毒是一项必不可少的工作。消毒既要杀死外植体上的病菌，又要损伤材料，影响其生长。由于不同的材料、不同的培养条件和季节，不同的外植体应采用各自适宜的消毒剂种类、消毒剂浓度、消毒时间和处理程序进行消毒。

理想的消毒剂应具有较强的杀菌能力，且应易于去除，不易损伤外植体。常用的有次氯酸钠(0.5% ~ 10%)和漂白粉(1% ~ 10%)滤液，能分解产生具有杀菌作用的氯气，自行散发到空气中。只要浓度合适，一般不会伤害外植体。双氧水(3% ~ 10%)也容易分解，不易损伤外植体。酒精(70%)渗透力强，有杀菌作用，易挥发，但会杀死组织和细胞，所以消毒时间不宜过长。常用酒精先消毒几秒钟，有利于其他消毒剂渗透到材料中发挥杀菌作用。

消毒方法和程序因不同的材料而异。通常用酒精(70%)浸泡数秒，取出后用10%次氯酸钙饱和上清液浸泡10 ~ 20分钟或2% ~ 10%次氯酸钠溶液浸泡6 ~ 15分钟，然后用无菌水冲洗三次。

2.外植体的增殖

外植体的增殖是组织培养的关键阶段。接种后，培养容器在培养室。一般每天光照16小时，1500 ~ 3000勒克斯，温度25℃左右进行分化培养。为了扩大新芽形成后的繁殖系数，需要进行继代培养。将材料分成植株或切片转移到增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上改良，以提高增殖率。经过1个月的增殖培养后，可根据情况重新增殖，继代后可增加植株数。

继代培养中，由于外植体本身来自无菌环境，不需要消毒，操作方便。但继代培养中外植体的分化能力会逐渐降低，所以继代代数不是无穷无尽的。

3.根诱导

继代培养形成的不定芽和侧芽一般没有根，必须转移到生根培养基上进行生根培养。生根培养基多为1/2MS培养基，因为降低无机盐浓度有利于根的分化。此外，生根培养基与增殖培养基在激素的种类和浓度上有很大不同，如细胞分裂素和生长素等。一般来说，细胞分裂素抑制生根，而生长素促进生根。

一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得壮根。此外，生产中也有试管苗具有根原基，即只在生根培养基中培养7 ~ 10天，诱导出根原基或小于1 mm的幼根后再用于移栽，由于基部切口已愈合形成根原基，不易被侵染，定植后生根快，成活率高。

4.组培苗的炼苗和移栽

生根或形成根原基的试管苗从无菌、稳定的光、温、湿环境进入自然环境，从异养向自养的转变过程，必须经过一个驯化锻炼过程，这就是炼苗。

一般在移栽前，打开培养容器的盖子，在室内自然光下放置3天，然后取出幼苗，用自来水冲洗根部的琼脂，再种入准备好的基质中。基质通常是泥炭、珍珠岩、蛭石、米糠灰等。或者适当添加一些园土，使用前最好用高温或药物消毒。移栽前期要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度(相对湿度90%左右)。但注意基质不宜过湿，不要积水，以防烂苗。此外，温度对存活率也有很大影响，最适温度为15 ~ 25℃。夏天温度过高，水分少的时候幼苗容易枯萎，水分多了容易腐烂，管理难度大，成活率下降。经过4 ~ 6周的炼苗，待新梢开始生长后，即可转入正常管理。