找出RNAi技术和TALEN技术的优缺点

ShRNA可以在干细胞、神经细胞、胚胎干细胞等难以转染的细胞中高效表达蛋白质。他的启动子都是外源的，表达蛋白的翻译后修饰可能不够真实，TALEN可以更好的弥补他的缺陷。首先，构建了目标识别模块。TAL的核酸识别单位是重复的34个恒定氨基酸序列，其中12和13位的双氨基酸与A、G、C和T有恒定的对应关系，即ng识别T，HD识别C，NI识别A，NN识别G..为了获得用于鉴定特定核酸序列的TALE，只需要根据DNA序列连续克隆相应的TAL单位。由于物种的基因组大小不同，所选择的特定序列的长度也不同。对于哺乳动物，包括人类，一般选择16-20bp的DNA序列作为识别目标。第二，

塔伦基因敲除

核酸内切酶TALEn可以通过将识别特定DNA序列的Tale与核酸内切酶FokI偶联来构建。而且FokI需要形成二聚体才能发挥活性，大大降低了随机剪切的概率。在实际操作中，需要在目的基因的编码区或外显子与内含子的交界处选择两个相邻(相隔13-22个碱基)的目的序列(一般为16-20个碱基)分别构建TAL识别模块。将两个相邻的靶识别模块融合，克隆到FokI的N端，形成真核表达载体，获得TALEN质粒对。

可以通过将TALEN质粒对转移到细胞中来敲除目标基因。通过TALEN质粒将* * *转入细胞后，表达的融合蛋白分别与靶位点特异性结合。由于两个TALEN融合蛋白中的FokI相互靠近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶的活性，在两个靶位点之间切割DNA，形成DSB(双链断裂)，诱导DNA损伤修复的机制。细胞可以通过NHEJ(非纯合末端连接)来修复DNA，在这个修复过程中或多或少地缺失或插入一定数量的碱基，导致移码，形成目的基因敲除突变体。

TALEA的转录激活

识别特定DNA序列的TALE与转录因子激活结构域VP64融合，以构建识别启动子上特定DNA序列的转录激活因子TALEA。在实际操作中，需要选择目标基因启动子上游的目标序列(一般为12-18碱基)来构建TAL识别模块。将识别模块TALE融合并克隆到VP64的N端，形成真核表达质粒TALEA。将TALEN质粒转入细胞，表达的融合蛋白与启动子附近的特定DNA序列结合，并通过VP64激活区与Pol II结合，从而激活基因转录，提高内源目的基因的表达。