转基因微生物制药的基本流程简介

1.目标基因是指编码蛋白质的结构基因。

2.原核基因是直接分离出来的，真核基因是人工合成的。合成目的基因常用的方法有逆转录法和化学合成法。

3.目的基因的PCR扩增

原理(1): DNA双链复制

(2)流程:

第一步:加热到90 ~ 95℃使DNA熔化；

步骤(2):冷却至55-60℃，并将引物结合到互补DNA链上；

步骤(3):加热至70 ~ 75℃，用热稳定的DNA聚合酶从引物合成互补链。

第二步:基因表达载体的构建。

1.目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在并能遗传给下一代，使目的基因得以表达并发挥作用。

2.组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因。

启动子(1)是一段具有特殊结构的DNA片段，位于基因的头部，RNA聚合酶在此识别结合，并能驱动基因转录mRNA，最终获得所需的蛋白质。

(2)终止子:也是一种具有特殊结构的DNA片段，位于基因的末端。

(3)标志基因的作用是鉴别受体细胞是否含有目的基因，从而筛选出含有目的基因的细胞。常用的标志基因是抗生素基因。

步骤3:将目标基因导入受体细胞

1.转型的概念:

它是目的基因进入受体细胞并在受体细胞中保持稳定表达的过程。

2.常见的转换方法:

将目的基因导入植物细胞:农杆菌转化是最常用的方法，其次是粒子轰击和花粉管通道法。

将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。这种方法的受体细胞多为受精卵。

将目的基因导入微生物细胞:原核生物因其繁殖快、细胞单一、遗传物质相对较少而被用作受体细胞。最常用的原核细胞是大肠杆菌。转化方法是先用Ca2+处理细胞成为感受态细胞，然后将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中，与感受态细胞混合，促使感受态细胞在一定温度下吸收DNA分子，完成转化过程。

3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体的受体细胞的依据是标记基因是否表达。

步骤4:目标基因的检测和表达。

1.首先，需要利用DNA分子杂交技术检测目的基因是否插入转基因生物的染色体DNA中。

2.其次，需要检测目的基因是否有转录的mRNA，方法是用标记的目的基因作为探针与mRNA杂交。

3.最后，从转基因生物中提取蛋白质，与相应的抗体进行抗原抗体杂交，检测目的基因是否翻译成蛋白质。

4.有时需要鉴定个体的生物学水平。比如转基因抗虫植物是否具有抗虫性状。

“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制性内切酶)

(1)来源:

主要从原核生物中分离纯化。

(2)功能:

它能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，断裂每条链特定部位两个核苷酸之间的磷酸二酯键，因此具有特异性。

(3)结果:

限制性内切酶切割产生的DNA片段的末端通常有两种形式:粘端和平端。

“分子缝合针”——DNA连接酶

(1)两条DNA连接酶(e？大肠DNA连接酶和T4-DNA连接酶)；

①相似性:均为磷酸二酯键缝合。

②差异:

e？大肠杆菌DNA连接酶来源于T4噬菌体，它只能连接双链DNA片段的互补粘性末端之间的磷酸二酯键。T4DNA连接酶可以缝合两种末端，但连接平端的效率较低。

(2)与DNA聚合酶作用的异同:

DNA聚合酶只能在现有核苷酸片段的末端添加一个核苷酸，形成磷酸二酯键。DNA连接酶连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

“分子运输工具”-载体

(1)载波的条件:

①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②它有一个或多个限制酶切点，用于插入外源DNA片段。

③有识别和选择重组DNA的标记基因。

(2)最常用的载体是什么？质粒是一种裸露的、结构简单的、不依赖于细菌染色体并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

(3)其他载体:噬菌体、动植物病毒的衍生物。

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