请生物专业的学生帮助介绍“PCR”
一、PCR概述
1，什么是PCR
聚合酶链式反应(PCR)也称为体外特定DNA序列的无细胞分子克隆或引物导向的酶促扩增。由美国科学家PE(Perkin Elmer Perkin-Elmer)遗传系的Mullis博士发明，由于PCR技术在理论和应用上的划时代意义，Mullis获得了1993诺贝尔化学奖。
2.PCR技术的发展历史
PCR的原理是由一对引物介导，能在动物和植物的体外快速酶促扩增特定的基因(DNA)片段。经过N个热循环的扩增后，扩增产物中特异性基因的数目为(1+e) n (0 < e < 1，扩增效率为=倍，使得检测扩增产物中的特异性基因成为可能。
聚合酶链反应从1993开始经历了四代产品:
第一代:人工/机器人水浴基因扩增
如上图所示，用三个恒温水浴箱将三个水浴的温度保持在三个温度:PCR的高温变性温度(如94℃)、低温复性温度(如58℃)和适当的温度延伸温度(如72℃)。然后用装有PCR标本试管的篮子用手依次在不同温度的水浴箱中洗澡，每个水浴箱中标本的恒温时间用秒表计时。这样，PCR样品可以完成以下形式的热循环:
94℃30秒58℃45秒72℃60秒
40个周期
这种方法的特点是:实验人员劳动强度大，容易因疲劳而产生误差；优点是:设备简单，投资少，与全自动基因扩增仪相比，不需要升降温过程，实验时间短，实验更接近理想的PCR反应条件。事实表明实验效果还是不错的，但是由于标本管从一个水浴箱移动到另一个水浴箱时暴露在空气中的时间较短，如果移动速度不够快也会对标本造成温度干扰，影响结果。这种方法的其他缺点还包括只能限制在三个温度步骤(有些PCR反应需要三个以上的温度步骤)，液体污染，在低压区很难将水温烧至94℃变性温度。
为了提高该方法的自动化水平，设计了机械手装置来代替上述人工移动标本的过程，并组成了机械手水浴式基因扩增仪。这一改进解决了实验人员高强度劳动的问题，但也带来了机械手部件在长行程中频繁相对运动导致的高故障。这种类型的基因放大器在90年代中期的北京和上海都有销售，并且被广泛使用。它曾为我国分子生物学的发展做出过积极的贡献，后来逐渐被自动化程度更高的放大器所取代，现在很少被单位使用。
第二代:自动控制定性基因扩增仪
相对于上述水浴式放大器，有人称之为干式基因放大器，是最具代表性的放大器，包括后面介绍的第三代和第四代，都是在第二代的基础上，集成了定量检测部分。
第三代:终点定量/半定量
第二代定性PCR只能判断阴性和阳性，不能评价特定核酸的浓度和定量分析。定量PCR至少可以实现以下定性PCR无法实现的功能:
？潜伏病毒浓度检测
？感染程度
？致病病原体的量变测定
？抗病毒药物的疗效评价
？恢复期病毒载量的检测
自从美国ABI公司在1996年发明了第一台荧光定量PCR仪以来，PCR技术和应用从定性到定量发展迅速。终点定量PCR的优点是设备投资少。对于国内经济条件负担不起昂贵的实时荧光定量PCR仪的科研单位和医疗机构，可以使用现有的第二代常规定性PCR仪，增加专用单孔PCR终点产物荧光定量检测仪开始工作，发挥定量作用。终点定量PCR技术是从定性向实时定量过渡的中间产物。而进口产品较少，国产仪器较多，如Xi安天龙的TL988和上海灵光的DA620。
第四代:实时定量PCR
实时定量QCPR仪+实时荧光定量试剂+通用计算机+自动分析软件构成QPCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
见下图:(略)
2.实时荧光定量PCR的优势:
该设备由荧光定量系统和计算机组成，用于监测循环过程中的荧光。连接到实时设备的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示出来。原始数据被绘制成荧光强度对循环次数的图。收集原始数据后，就可以开始分析了。实时设备的软件可以对采集的数据进行归一化处理，以弥补背景荧光的差异。标准化后，可以设置阈值水平，这是分析荧光数据的水平。样本达到阈值水平时所经历的循环次数称为Ct值(极限点的循环次数)。阈值的设定应使指数期的扩增效率最大化，这样才能获得最准确和可重复的数据。如果同时还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析会产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。
3.实时荧光定量PCR技术原理。
所谓实时Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时技术的发展中，有两个重要发现起着关键作用:(1)90年代初，Taq DNA聚合酶的核酸外切酶活性的发现，可以降解特定的荧光探针，使得间接检测PCR产物成为可能。(2)之后，利用荧光双标记探针在密闭的反应管中实时监测整个反应过程。这两个发现的结合以及相应仪器和试剂的商业化发展导致了实时Q-PCR在研究工作中的应用。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数呈指数增长。随着反应循环次数的增加，最终的PCR反应不再指数生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，经常使用凝胶电泳分离和荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此通过这种终点方法来定量PCR产物是不可靠的。在实时Q-PCR中，实时监控整个PCR反应扩增过程，并连续分析与扩增相关的荧光信号。随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成曲线。在PCR反应的早期，荧光的水平无法与背景明显区分，然后荧光产生进入指数期、线性期和最终平台期，因此可以在PCR反应的指数期的某一点检测PCR产物的量，并由此推断模板的初始含量。为了方便地比较检测的样品，在实时Q-PCR反应的指数期，需要设置一定的荧光信号阈值。该阈值一般以PCR反应前15个循环的荧光信号为荧光背景信号，默认设置为3 ~ 15个循环荧光信号标准差的65438。如果检测到的荧光信号超过阈值，则认为是真实信号，可用于定义样品的阈值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数。研究表明，每个模板的Ct值与模板初始拷贝数的对数之间存在线性关系。初始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知初始拷贝数的标准品可以制作标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，就可以从标准曲线计算出样品的初始拷贝数。
4.实时荧光定量PCR技术在医疗中的应用。
⑴病原体检测:目前可利用荧光定量PCR检测技术对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒、巨细胞病毒等病原体进行定量检测。与传统检测方法相比，它具有灵敏度高、样品用量少、快速简便等优点。
例如，结核病基因诊断的意义主要在于:
A.将结核杆菌与其他分枝杆菌区分开来；
B.检测结核耐药基因；
C.提高结核病的阳性检出率。
⑵产前诊断:到目前为止，人们还不能治疗遗传物质改变引起的遗传性疾病，只能通过产前监测减少患病婴儿的出生，从而预防各种遗传性疾病的发生。比如为了减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇外周血中分离胎儿DNA，通过实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因，是一种无创的方法，孕妇容易接受。
⑶药物疗效评价:对乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)的定量分析表明，病毒的多少与某些药物的疗效有关。高水平的HCV表达对干扰素治疗不敏感，而低滴度的HCV对干扰素治疗敏感。在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量一度下降，之后又再次上升或超过以前的水平，提示病毒发生了变异。比如PCR在HBV检测中的应用和意义；
A.了解体内乙肝病毒的数量。
B.是否复制。
C.是否有传染性，传染性有多大。
D.是否有必要吃药。
E.肝功能异常变化是否由病毒引起。
F.判断什么样的抗病毒药物适合患者。
G.判断药物治疗的疗效。
⑷肿瘤基因的检测:虽然肿瘤的发病机制尚未明确，但相关基因的突变是致癌转化的根本原因已被广泛接受。癌基因表达的增加和突变可出现在许多肿瘤的早期。实时荧光定量PCR不仅能有效检测基因突变，还能准确检测癌基因的表达。目前，该方法已用于检测端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关病毒基因等的表达。随着肿瘤相关新基因的发现，荧光定量PCR技术将在肿瘤研究中发挥更大的作用。
(5)在优生学中的应用:
近年来，随着经济的快速发展和人民生活水平的逐年提高，人们越来越关注自己和家人的健康，尤其是下一代的健康。此外，由于我国计划生育工作的逐步深入，独生子女增多，孩子的身体素质成为长辈关注的焦点。因此，如何提高新生儿的素质和人类的遗传素质，也就是优生优育，变得非常重要。①避免有严重遗传性疾病和先天性疾病的个体出生。②促进体力和智力优秀的个体繁衍。其中，避免有严重遗传病和先天性疾病的个体出生，是优生优育最基本的内容。从临床优生学的角度来说，具体工作包括孕期对母亲和胎儿进行基因检查，尽量排除常见遗传性疾病的出生，检查母亲孕期是否有弓形虫、风疹病毒、衣原体等一些容易导致胎儿畸形的感染性疾病。以前主要用染色体分析来检测遗传病，但临床上大多数遗传病都是遗传病而不是染色体病，染色体分析检测不出来。如果采用PCR基因扩增结合单链构象多态性分析(sscp)、限制性片段长度多态性分析(RFCP)、等位基因特异性寡核苷酸酸(Aso)点杂交或差异PCR，可以很容易地检测出单个基因的突变，准确率可以达到95%以上，所以这个问题得到了很好的解决。易导致胎儿畸形的常见传染病病原体有单纯疱疹病毒(HSV)、风疹病毒(RV)、人巨细胞病毒(HCMV)、TOX和沙眼衣原体(CT)。以往对这些病原体感染的诊断比较困难，主要通过培养方法进行诊断。但培养法费时、费钱，且受取样、标本保存和用药的影响，无法在临床上推广。PCR基因扩增法由于具有较高的敏感性和特异性，非常适合用于这些疾病的诊断和疗效追踪，是最值得推荐的检测方法。
1.PCR基因扩增法在遗传病产前诊断中的应用。遗传性疾病是由于基因改变导致机体的某种功能、缺陷或异常而引起的疾病，根本的改变在于遗传物质。其类型包括单基因遗传病、染色体遗传病和多基因遗传病。遗传病的诊断除了询问病史、一般体格诊断、一般实验室检查和了解症状体征外，还有其特殊性。以往常以系谱分析、染色体和性别染色作为遗传病诊断的主要依据，辅以相关酶学分析做出诊断。随着分子生物学的迅速发展及其在遗传性疾病诊断中的广泛应用，基因诊断技术诞生了，极大地促进了遗传性疾病的临床诊断。聚合酶链反应(PCR)是基因诊断的主要技术之一。这种快速灵敏的体外基因扩增技术可以检测大多数已知的基因突变、基因缺失、染色体错位等。PCR技术正日益成为诊断遗传病最有效、最可靠的方法之一。这里有几个在中国具有普遍意义的例子。
(1)通过PCR检测地中海贫血；地中海贫血是一种遗传性慢性溶血性贫血，是世界上最常见也是最常见的单基因遗传病。在广东、广西、贵州、四川等地发病率较高，广西等地达到15%。地中海贫血是由于基因突变导致珠蛋白失衡，使结构正常的肽链合成减少甚至不能合成，表现为溶血性贫血。接受基因的类型分为α、β、γ，其中α、β地中海贫血最常见，危害最大。珠蛋白基因簇位于人类6号染色短臂上，有两个重复基因位于α1，α2，两个α基因及其侧翼序列同源性很大，容易发生染色体不等交换，导致α基因缺失-α地中海贫血。α地中海贫血基因部分缺失包括α1基因部分缺失、α2基因缺失、α1和α2基因同时缺失和非缺失型地中海贫血。PCR可用于扩增α1和α2基因，检测这些基因是否缺失或突变，从而诊断α地中海贫血。β地中海贫血的基因缺陷主要表现为基因序列中单个核苷酸的突变，或少数碱基的缺失或插入，使正常的β珠蛋白肽链合成减少或缺失。PCR产物与位点特异性寡核苷酸探针(Aso)的点杂交可用于诊断。
(2)苯丙酮尿症:苯丙酮尿症(PKU)是一种常染色体隐性遗传病。由于苯丙酸羟化酶转化为酪氨酸，苯丙氨酸及其代谢产物在体内蓄积，导致脑损伤和不可逆的智力低下。PKU患者出生时正常。新生儿一旦确诊为PKU，停止母乳喂养，采用低苯丙氨酸口服治疗8-10年，可保持患者智力水平发育正常。因为口服低苯丙氨酸非常昂贵，普通家庭难以承受。所以产前诊断是防止孩子出生的最佳选择。PAH只在肝细胞中表达，酶活性无法通过血细胞、成纤维细胞、羊水、绒毛膜细胞分析，只能通过基因诊断。PKU的基因改变不是所有PAH基因的缺失，主要形式是点突变，突变位点多。必须使用PCR扩增、ASO、SSCP或扩增片段长度多态性分析(AmpFLA)进行检测。这些技术很复杂，检查员必须经过专业培训。
(3)血友病，血友病是一组最常见的遗传性凝血障碍，根据因子缺陷的不同可分为两种，(因子ⅷ和ⅶ缺陷)，也有复杂性血友病，但不常见。血友病A的发病率为1/10000，因子VIII基因位于G6PD基因附近，全长186Kb。广泛基因重排(缺失、插入和重复)导致的血友病A病例很少，仅占因子ⅷ缺陷的5%，大多数患者表现为单个或少数碱基突变。由于因子ⅷ基因长度为186Kb，突变位点多，新突变频率高，从临床角度不可能检测到每一个突变，可以检测到几种常见的突变类型。主要的检测方法是PCR结合RELP分析。血友病B的发病率占血友病的20%，其基因改变和检测方法与血友病a相似。
(4)性发育异常。区分男女的物质基础是性染色体。在哺乳动物胚胎发育中，雌性表型不需要任何调节，而雄性表型由许多因素决定。位于Y染色体上的基因指导男性的SSS，被称为睾丸决定簇(TDF)。现代研究表明，SRY(Y染色体性别决定区)基因是TDF基因，位于Y染色体短臂末端。SRY区的缺失容易导致46XY核型个体发育为雌性。基因检测可以检测SRY基因组的易位和缺失，从而诊断性别发育异常。这项探索性别异常的研究很受欢迎。此外，还有一种46XY核型异常的患者，即睾丸女性化，这是由于雄激素受体(AR)基因的缺失，使雄激素的靶基因对雄激素没有反应或回答不完全所致。根据病情不同，有不同的表现型，AR缺乏症新突变频率高，表现为散发性疾病，无家族史。AR基因长90Kb，位于X染色体上。AR基因异常多为个别基因的碱基突变，可通过PCR结合ASO或SSCP检测出来。
(5)脆性X综合征，脆性X综合征(FRAX)是一种发病率最高的X连锁精神发育迟滞综合征(XLMR)。它之所以被命名，是因为这种综合征与X染色体上的脆性部位有关。大多数FRAX男人的智商都在50以下，而且随着年龄的增长，智商有下降的趋势。通过人工酵母染色体(YAC)克隆技术分离出一个覆盖X-脆性位点的YAC克隆，并在该克隆中获得了一个能在人脑中表达的基因，命名为FMR-1(脆性X-mentai阻滞-1)。在FMR-1的5’端有一个CGG三核苷酸串(CGG)n。正常人群中(CGG)n存在多态性，有6-46个重复。当重复数超过52时，该区域的划分不稳定，导致重复数大量增加。无临床表现的载体插入片段长度小于500bg，是临床的。人们把500bp作为预突变和全突变的分界线。在Frax诊断之前，细胞遗传学用于检测脆性位点，但实验条件严格，成功率不高。目前可以通过分子遗传学诊断预突变和全突变。通过PCR扩增CGG重复序列，并检测扩增产物的长度。突变基因的扩增片段被放大，出现体细胞异质性时出现多条长短不一的扩增带甚至是一条尾巴，或者因为扩增的全突变插入片段过长超过PCR扩增能力而没有扩增现象。
2.PCR基因扩增技术在“Torsch”诊断中的应用。在妊娠早期(1-3个月)，一些病原微生物容易引起胎儿畸形。最常见的病原体是托克斯病毒、风疹病毒(RV)、单纯疱疹病毒(HSV)、沙眼衣原体(CT)和巨细胞病毒(HCMV)。
(1)弓形虫PCR检测表明，弓形虫自然疫源地广泛，人体内多为隐性感染，在抵抗力较低时可有临床表现。弓形虫诊断困难，血清学方法敏感性高，但存在交叉假阳性且无法确定近期感染、长期感染或短暂感染。诊断的方法是活检或动物活检，这些方法的阳性率太低，难以推广。PCR检测可检出样本中1-2病原体，准确率高，是目前检测弓形虫最好的方法。作为产前产后检查，应在孕前或孕早期抽取全血样本。可使用EDTA或肝素抗凝，EDTA抗凝效果最好，用于检测外周血白细胞中是否存在TOX。弓形虫检测对于不孕、反复自然流产或饲养小动物的产妇有更重要的临床意义。
(2)风疹病毒感染:风疹病毒(RV)是单一阳性RNA病毒，人类是风诊病毒的唯一宿主。RV感染可导致胎儿畸形，影响胎儿免疫系统的发育，因此RV检测在产前和产后保健中非常重要。RV可通过直接培养和IgM抗体试验进行检测。培养方法耗时长，且常受其他病毒干扰。IgM法不准确，PCR法敏感特异，简单快速，是RV感染的最佳检测方法之一。风疹病毒侵入体内后在上呼吸道内增殖，导致面部出现症状和丘疹，并迅速扩散至全身。样品为孕妇的咽拭子、血清、孕妇绒毛或孕妇羊水等。RV病毒是RNA病毒，PCR扩增比较复杂，要注意样本采集的时机和操作的准确性。
(3)单纯疱疹病毒:单纯疱疹病毒(HSV)是一种DNA病毒，可引起多个器官的炎症，可通过性接触传播。HSVⅱⅱ感染复发率高，80%的感染者在12个月内复发。HSV感染被免疫系统消除后，少数患者终身携带，虚弱时复发。PCR检测HSV敏感，可直接鉴定HSVⅰ/ⅱ型。
(4)沙眼衣原体，沙眼衣原体(CT)是一种性传播疾病，不仅可引起沙眼还可引起生死器官的感染。与淋病(NG)、梅毒等经典性传播疾病不同，CT很容易通过其他接触途径传播。少数地区孕妇调查结果显示，该人群发病率高达20%-30%。在欧美等国家，CT感染已经超过淋病，位居性传播疾病之首。衣原体感染往往是隐性感染，无症状或无特异性症状，不易诊断。过去的培养方法耗时长，缺乏灵敏性和准确性。PCR用于CT检测时，要注意针对不同的检测目的使用不同的材料。对于性传播疾病的诊断，要取生殖道分泌物(查脱落细胞)，而对于早孕患者，要查其全血样本，然后在孕晚期或临产时查阴道分泌物，以指导产道的清理。
(5)人巨细胞(HCMV)，HCMV感染十分常见，除少数原发感染伴有原发性单核细胞增多症外，大部分为隐性感染。HCMV可以在体内潜伏很长时间。当机体免疫功能低下时，病毒就会激活，引发严重疾病。如果孕妇在怀孕期间感染HCMV，会导致早产、畸形、死胎和新生儿巨细胞包涵体病。HCMV属于疱疹病毒家族，可从唾液、尿液、宫颈分泌物和乳汁中分泌。HCMV的“金标准”诊断检测是用单层成纤维细胞进行病毒培养，其他实验检测包括血清学检测和包涵体检测。PCR是一种新的HCMV检测方法，用于检测的样本包括血液、生殖道分泌物拭子等。用于产前和产后保健时，应采集血样。对于妊娠早期HCMV感染患者，应再次检测羊水或其他妊娠产物，并对患者进行仔细随访，以做出综合判断并采取相应的医学措施。
PCR在优生学中的应用具有很大的优势，使得这项技术的推广应用才刚刚起步。应注意手术的准确性，尽量避免误诊。对于传染病，应先取孕妇血样进行检测，当有怀疑或血液中检出病原体核酸时，应尽快对孕妇进行羊水等检查。无论是否怀疑胎儿有严重的遗传易感性和中度的感染导致畸形的风险，都应尊重胎儿父母的意见。
5.实时荧光定量PCR技术在研究中的一些应用。
一是新药、人用药物和其他药物的研发
对于一些感染性疾病药物，如各种病毒性疾病、细菌性疾病，在新药研发过程中，可以为新药研发节省大量的人力、时间和资金。与Elisa和以前使用的其他方法相比，实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量和灵敏地确定血液或组织中病原体的含量，因此有助于分析药物的效果，以及比较不同配方的疗效、剂量和成本。
该方法不仅可用于人类药物，也可用于动物药物，甚至可用于其他经济动植物的药物研究，因此其在药物研究中的应用范围非常广泛。
二是超早期感染药物和疗法的研发
实时荧光定量PCR用于确定血液中病毒核酸的含量，因此不必等到患者体内产生抗体。同时，由于其灵敏度与Elisa不可同日而语，因此可在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低的时候确定。所以出现了一个新的领域，就是在病毒或细菌含量很低的情况下如何用药，用什么药，用药量多少等等，为在超早期消灭疾病做出贡献。
三、药物疗效研究，人用药物和其他药物
对于一些已经上市的新药或长期使用的老药，可以进一步研究用药的效果、剂量和时间，从而进一步研究这些药物的合理应用，造福人类。因为过去用的方法不能准确量化，灵敏度不够，所以需要研究的东西很多。一方面，这个领域有很多值得研究的地方，也有很重要的意义。
第四，研究新的预后指标
对于感染性疾病，认为药物作用到一定程度后可以停药，但目前还没有明确的何时停药的指标。由于检测方法的灵敏度和准确度的限制，这个指标可能并不合理。因此，有必要进一步研究治愈指数及其与复发率的关系以及疾病向其他疾病的转化，为药物或疗法彻底治愈疾病奠定坚实的理论基础。
动词 （verb的缩写）开发新的诊断和测试试剂
现有的许多诊断检测方法不能同时满足快速、灵敏和定量的要求，如现有的培养法和Elisa法，而荧光定量PCR法可以做到这一点，从而为临床疾病、商品检验、粮油检验、食品检验、血液检验等开发新的试剂。，从而提高检查的灵敏度、速度和准确度等。这类试剂种类繁多，研制出来的试剂社会效益和经济效益是巨大的。
六、血液检验漏检率
由于实时荧光定量PCR比Elisa灵敏得多，血站或血液研究所一般用它来研究Elisa的漏检率，即分析Elisa为阴性的血液样本，再用实时荧光定量PCR复检。复检时，一般是将24份Elisa阴性的血样混合成一份样本进行检测。用这种方法在上海血液制品使用的血液中发现了一例HIV，通过对供体的检测，确认患者为HIV阳性。北京市红十字血液中心正在测算北京血站5万份Elisa阴性血样的漏检率。因为不同地区使用的Elisa试剂、方法、批号都不一样，所以需要在不同地区开展这项工作。
由于荧光定量PCR快速、灵敏、定量的特点，其在研发中的应用众多，如研究个体基因型与药物疗效的关系。研究人员也可以根据自己的研究项目开发新的用途。
TL988实时荧光定量PCR检测系统产品介绍
1，如何选择合适的PCR仪
回顾分子生物学的发展，PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。在近20年来PCR技术的不断发展和创新中，最引人注目的是实时定量PCR (ORQPCR)。定量PCR技术真正实现了从定性到定量PCR的飞跃。通过实时监控PCR过程，可以特异、灵敏、快速、可重复地准确定量初始模板浓度，在科学研究和临床诊断中得到了越来越广泛的应用。我公司从荧光定量PCR的原理入手，详细介绍了荧光定量PCR仪的种类和技术，为定量PCR仪的选择提供了详细的参考。
定量PCR仪主要由两部分组成，一部分是PCR系统，另一部分是荧光检测系统。从上面的原理介绍中不难看出选择定量PCR仪的关键——因为定量PCR必须通过样品和标准品的对比来进行定量，对于一个定量PCR系统来说，重要的参数不仅仅是温度控制的精度、温度上升和下降的速度等。传统PCR，而且样品孔之间的均匀性，以避免微小的差异被成倍放大。至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器的荧光素种类就越多，仪器的适用范围就越广；多通道是指可以同时检测一个样品中的多种荧光，仪器可以同时检测单个试管中的多个模板或内标+样品。通道越多，适用范围越广，仪器性能越强。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源包括卤钨灯光源、氩离子激光器和LED光源。前者可配多色滤光片实现不同激发波长，而单色LED价格低、能耗少、寿命长。但是因为是单色的，所以需要不同的led来更好的实现不同的激发波长。监控系统包括超低温CCD成像系统和光电倍增管。前者可以一次成像多个点，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样本。逐个扫描检测多个样本需要很长时间。定量PCR仪需要考虑的另一个因素是软件设计，目前较新的仪器都有很好的配套软件来满足日常使用。-随着定量PCR技术在临床诊断中的应用，疾病