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随着植物抗病基因工程的发展，越来越多的抗病基因被发现。2004年，Taler等人从印度野生甜瓜品种中克隆了两个具有丝氨酸乙醛酸转氨酶(SGT)活性的甜瓜霜霉病抗性基因At1和At2。Taler等发现At1和At2具有与植物光呼吸途径相关的丝氨酸乙醛酸转氨酶活性，不属于任何已知的R基因，对病原菌的抗性没有种属特异性，其抗病性与H_2O_2有关。基于这一现象，他们提出了一种新的抗病机制“酶抗病”，这是首次报道通过改变酶的表达赋予植物抗病性。推测At1和At2可能还对除霜霉病以外的其他多种植物叶部病害具有抗性，是极具研究价值的抗病基因。而且“酵素抗病”的机理还需要更多的遗传学证据和实验支持。基于此，从光呼吸极强的大豆中克隆了At1和At2的同源基因GmSGT，并对其进行了序列分析、酶活性中心预测和原核表达分析，将其转入受体植物进行抗病性鉴定。本文的主要研究成果和创新点概括如下:1。利用大豆EST序列和5’-Race技术，首次从大豆抗霜霉病品种中克隆出编码丝氨酸乙醛酸转氨酶的GmGGT1基因序列(已获得1项国家发明专利，专利号:ZL2005100887 83.4)。同时，从SA诱导的感病品种黑农10中克隆了GmSGT1的两个同源基因GMS GT 2和GMS GT 3。序列分析表明，GmSGT1与Taler等报道的甜瓜霜霉病抗性基因At1和At2的氨基酸序列分别有88.03%和87.78%的同源性，同时与拟南芥、水稻、贝母和多叶浮萍的丝氨酸乙醛酸转氨酶有83.33%-85.79%的同源性。对从GmSGT1推导的蛋白质的序列分析表明，它具有吡哆醛-5-磷酸结合位点GSQKAL和强的过氧化物酶体定位信号SRI，这表明该基因可能通过光呼吸在植物过氧化物酶体中发挥作用。GmSGT2和GmSGT3与GmSGT1的核苷酸序列同源性高达96.38%和99.17%，推导的氨基酸序列同源性为97.03%和99.25%。用生物信息学方法分析了GMS GT 1、GMS GT 2和GMS GT 3的酶活性中心。结果表明，三个蛋白序列都具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。2.通过在大肠杆菌中模拟植物光呼吸途径，首次发现GmSGT1具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。光呼吸途径中的反应:乙醇酸(？H2O 2+乙醛酸；乙醛酸(？)乙醛酸。因为大肠杆菌含有乙醇酸氧化酶(GOX)，所以可以通过向原核表达菌株中加入乙醇酸来完成上述反应。通过检测H2O 2含量的变化，可以确定GmSGT1基因的丝氨酸乙醛酸转氨酶功能。研究结果表明，只有表达GmSGT1蛋白的组分能诱导产生大量的H2O 2，而对照组则不能。因此，可以证实GmSGT1具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。3.分析了GmSGT蛋白与不同大豆品种抗性的相关性。Western杂交结果表明，在抗霜霉病品种早丰5号和九农9号中可检测到目的蛋白的表达，而在感病品种黑农10中未检测到目的蛋白的表达。SA诱导前后半定量RT-PCR结果表明，感病品种黑农10在SA诱导前未检测到表达，但在SA诱导后略有表达，大豆对冻害的抗性大大提高。因此，我们推断GmSGH的表达确实与SA诱导途径有关，并且随着GmSGT1表达量的增加，大豆对霜霉病的抗性也明显提高。4.构建了植物表达载体GmSGT1，通过烟草转化获得了转基因植株，并对其抗褐斑病、黑胫病和青枯病进行了鉴定。结果表明，转基因烟草显著提高了烟草对褐斑病、黑胫病和青枯病的抗性。这项研究为Taler等人提出的植物“酶抗性基因”提供了新的实验证据5。以抗病品种早丰5号为材料，研究了转基因大豆GmSGT1基因在大豆中的时空表达特征。该基因在大豆叶片中表达，在根和茎中不表达，表达量随生长期的增加而增加，在生殖生长期表达最强，随后随着细胞的衰老而减弱直至消失。这说明GmSGT1的变化趋势与植物光呼吸的变化趋势是一致的。同时检测了光呼吸途径中作用于丝氨酸乙醛酸转氨酶上游的乙醇酸氧化酶(GOX)的表达特征。结果表明，GOX的表达水平与GmSGT1一致，表明GmSGT1的上游反应和H2O 2表达同时增强。这与我们的结论一致，即GmSGT蛋白在植物光呼吸途径中发挥作用。6.确定了大豆的遗传转化体系。建立了大豆早丰5号和黑农10的组织培养体系，通过农杆菌介导法将构建的植物表达载体pIM1.1-GmSGT-plus转化到早丰5号和RNAi植物表达载体pIM1.1-GmSGT-plusF中。同时研究了再生频率、再生时间、K筛选浓度和农杆菌不同感染时间对再生芽再生频率的影响，为进一步优化早丰5号的组织培养和转化体系提供了实验依据。

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随着植物抗病基因的发展，越来越多的抗病基因在人体内被发现。在2004年，Taler和其他来自印度的野生甜瓜抗霜霉病品种已经克隆了两个丝氨酸乙醛酸转氨酶(serineglyoxylate aminotransferase酶，SGT)活性甜瓜抗霜霉病基因At1和At2。Taler At1和At2是发现具有丝氨酸乙醛酸氨基转移酶活性和植物光呼吸途径的基因，不属于任何一类已知的R基因，对病原无特殊抗性的物种，它们的抗病作用与H2O 2有关。基于这一现象，他们提出了一种新的抗病机制“酶抗性”，这是首次报道通过改变酶的表达赋予植物抗病性。据推测，At1和At2可能对als o霜霉病具有比其他许多植物叶部病害更强的抗性作用，说明该抗性基因具有很大的研究价值，而“抗性酶”机制的提出需要更多的基因来支持和检验。据此，本文从大豆光呼吸克隆At1和At2中克隆了同源基因GmSGT，对其进行了序列分析、酶活性位点预测、原核表达分析，并转入受体植物中进行抗病性鉴定。现将论文的主要发现和创新点总结如下:1。利用大豆EST序列，并利用5’-Race技术首次从抗霜霉病大豆品种中克隆出编码丝氨酸乙醛酸转氨酶基因sequence gmg gt 1(已获国家发明专利，专利号:ZL2005100887 83.4)，从两个受SA诱导的感霜霉病大豆品种中，10黑农已克隆出两个GmSGT1的同源基因GmSGT2、GmSGT3。序列分析显示，GmSGT1与其他甜瓜霜霉病抗性基因报道的At1、At2氨基酸序列同源性高达88.03%和87.78%；同时，GmSGT1与拟南芥(Arabidopsis thaliana L .)，水稻(Oryzae sativa L .)，贝母(贝母属)，浮萍(Spirodela polyrrhiza)丝氨酸乙醛酸氨基转移酶同源性为83.33%-85.79%。GMS gt 1推导的蛋白质序列分析显示，其具有5-磷酸吡哆醛结合位点GSQKAL和强的过氧化物酶体靶向信号SRI，表明该基因可能在植物过氧化物酶体光合作用中GmSGT2和GmSGT3与GmSGT1核苷酸序列同源性高达96.38%和99.17%，推导的氨基酸序列同源性为97.03%和99.25%。通过生物信息学方法对GmSGT1、GmSGT2、GmSGT3蛋白的酶活性位点进行了分析，结果表明这三个蛋白序列均具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。光呼吸途径反应发生:乙醇酸(？)H2O 2+乙醛酸；乙醛酸(？)Gan氦酸。因为大肠杆菌含有乙醇酸氧化酶(GOX)，所以原始菌株通过添加酸来表达，通过上述反应来完成，通过检测H2O 2量的变化可以确定GmSGT1丝氨酸乙醛酸转氨酶基因的功能。结果表明，只有GmSGT1蛋白组分的表达才能诱导H_2O_2的大量产生，对照组分不能，因此，可以用丝氨酸来测定GmSGT1乙醛酸转氨酶的活性。Western blotting结果表明，抗霜霉病品种早5号和早9号农9号可检测到有目的表达，而黑农10号上感病且无表达。SA诱导前后的半定量RT-PCR结果表明，感病的黑农10号在SA诱导前未检测到表达，而SA诱导表达的微量大豆对奶油酶的抗性有很大提高。因此，我们推断，GmSGT1的诱导表达方式是真实的和相关的，并且随着GmSGT1表达量的增加，大豆对霜霉病的抗性也得到显著提高。4 .构建了GMS gt 1植物表达载体，用于烟草转化，获得了转基因植株，并获得了烟草对褐斑病、黑胫病、青枯病的抗性鉴定，结果表明转基因烟草显著提高了烟草对褐斑病、黑胫病、青枯病的抗性。塔勒等。这项研究提出了植物“酶抗性基因”，提供了新的实验证据。5.利用最早的5个抗病品种探索了GmSGT1丰基因在大豆中表达的时空特征，该基因在大豆叶片中表达，但在根、茎中不表达，并且随着生育期的推移而表达量增加，大部分在生殖阶段表达，然后随着细胞衰老表达量减少，直至消失。这表明植物GmSGT1光呼吸的趋势线。同时检测了光呼吸途径中上游丝氨酸乙醛酸转氨酶作用下乙醇酸氧化酶(GOX)的表达特征，结果显示GOX GmSGT1的表达水平变化一致，表明GmSGT1表达增强的同时，上游反应也增强了，H_2O_2表达也增加了。我们推测GmSGT这种植物光呼吸途径蛋白在结论中起作用。6 .研究鉴定了遗传转化系统。汇丰银行早在5、大豆、黑农10th上建立了胚尖组织培养体系，利用根癌农杆菌LBA4404介导的植物表达载体将优良成员pIM1.1-GmSGT-plus转化早期5、RNAi植物表达载体pIM1.1-GmSGT-plusF转化黑农1th上，获得了再生。同时，对汇丰5号的胚尖、子叶节、下胚轴三个外植体的再生频率、再生时间、K筛选浓度、农杆菌感染时间对不同再生频率的芽再生进行了研究，为5号组织培养、转化体系的进一步优化提供了实验依据。