美国mrna专利
在植物表达载体中构建特定的外源基因，并将其转入受体植物中，并不是植物遗传转化的最终目的。理想的转基因植物通常需要外源基因在特定部位和特定时间内高水平表达，以产生理想的表型性状。然而，近二十年的发展历史表明，外源基因经常出现在受体植物中，如表达效率低、表达产物不稳定甚至基因失活或沉默，导致转基因植物无法投入实际应用。此外，转基因植物的安全性在许多国家引起了人们的关注，例如转基因可能会随花粉传播，抗生素筛选标记基因可能会使一些临床抗生素失效。上述问题的出现，使得高科技植物基因工程处于前所未有的困境时期。为了解决这些问题，近年来，人们对植物转基因技术进行了多方面的探索和改进，植物表达载体的改进和优化是其中最重要的内容之一。本文总结了已经取得的进展。
1启动子的选择和转化
外源基因表达不足往往是得不到理想转基因植株的重要原因。因为启动子在决定基因表达中起着关键作用，所以首先要考虑的是选择合适的植物启动子并提高其活性。
目前，植物表达载体中广泛使用的启动子是组成型启动子。例如，大多数双子叶转基因植物使用CaMV35S启动子，而单子叶转基因植物主要使用来自玉米的泛素启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因将在转基因植物的所有部分和所有发育阶段表达。然而，外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成浪费，而且往往会引起植物的形态变化，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物中发挥有效作用，减少对植物的不利影响，人们越来越重视特异表达启动子的研究和应用。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。比如种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、伤害诱导启动子、化学诱导启动子、光诱导启动子、热激诱导启动子等等。这些特异启动子的克隆和应用为外源基因在植物中的特异表达奠定了基础。例如，瑞士CIBA-盖基公司利用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒素基因的表达。由于启动子可以被水杨酸及其衍生物诱导，所以在害虫复发的季节，通过喷洒廉价、无污染的化学物质来诱导抗虫基因的表达，显然是一种非常有效的方法。
在植物转基因的研究中，利用天然启动子往往无法获得满意的结果，特别是在进行特异性表达和诱导表达时，表达水平大多不理想。改造现有启动子，构建复合启动子将是一条非常重要的途径。例如，Ni等将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子结合，GUS表达结果显示，修饰后的启动子活性明显高于35S启动子。吴瑞等将诱导型PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1结合，新启动子的表达活性提高了近10倍(专利)。这些人工启动子在植物基因工程研究中发挥了重要作用。
2.提高翻译效率
为了增强外源基因的翻译效率，在构建载体时一般需要对基因进行修饰，主要考虑三个方面:
2.1添加5’-3’-非翻译序列
许多实验发现，真核基因的5’-3’-非翻译序列(UTR)对于基因的正常表达是非常必要的，该片段的缺失往往会导致mRNA稳定性和翻译水平的显著下降。如烟草花叶病毒(TMV)126 kda蛋白基因翻译起始位点上游有一个由68bp核苷酸组成的ω元件，为核糖体提供了一个新的结合位点，可将Gus基因的翻译活性提高数倍。目前，许多载体在外源基因的5’-末端添加了ω翻译增强序列。Ingelbrecht等人研究了各种基因的3’-末端序列，发现章鱼碱合成酶基因的3’-末端序列可以使NPTII基因的瞬时表达提高20倍以上。此外，不同基因的3’-末端序列在促进基因表达方面具有不同的效率。例如，RBC的3’-末端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3’-末端序列高60倍。
2.2围绕初始密码优化序列
虽然起始密码子在生物学中是普遍存在的，但不同生物来源的基因在起始密码子周围都有自己特殊的序列。比如植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC，动物起始密码子周边序列是CACCAUG，原核起始密码子周边序列与它们有很大的不同。科萨克详细研究了起始密码子ATG周围碱基的定点突变对转录和翻译的影响，得出结论:在真核生物中，起始密码子周围的序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，尤其是-3位的A对翻译效率非常重要。这个序列后来被称为科萨克序列，并被用于表达载体的构建。比如有一个细菌的几丁质酶基因，它最初的初始编码序列是UUUAUGG。当将其改造为ACCAUGG时，其在烟草中的表达量增加了8倍。因此，在用非植物基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周围序列的特点进行改造。
2.3转化基因编码区。
如果外源基因来自原核生物，由于表达机制的差异，这些基因在植物中的表达水平往往很低。例如，来自苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达水平很低，发现这是由于原核生物和植物基因的差异，导致mRNA稳定性下降。美国孟山都公司的Perlak等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的情况下，对杀虫蛋白基因进行了改造，选择了植物偏爱的密码子，增加了GC含量，去除了原有序列下影响mRNA稳定性的元素。结果表明，毒蛋白在转基因植株中的表达量提高了30 ~ 100倍，获得了明显的抗虫效果。
3消除位置效应
当外源基因转入受体植物时，其在不同转基因植物中的表达水平往往差异很大。这主要是由于外源基因在受体植物基因组中的插入位点不同。这就是所谓的“位置效应”。为了消除位置效应，将所有外源基因整合到植物基因组的转录活性区，目前的表达载体构建策略中通常考虑应用核基质结合区和定点整合技术。
基质结合区(Matrix association region，MAR)是一种存在于真核细胞染色质中的DNA序列，特异性结合核基质。一般认为，MAR序列位于活性转录DNA环状结构的边界，其功能是制造一种分割效应，使各转录单位保持相对独立，不受周围染色质的影响。相关研究表明，将MAR置于目的基因的两侧，构建含有MAR-gene-MAR结构的植物表达载体进行遗传转化，可以显著提高目的基因的表达水平，降低不同转基因植物间目的基因表达水平的差异，减少位置效应。例如，Allen等人研究了异源MAR(来自酵母)和同源MAR(来自烟草)对烟草中Gus基因表达的影响，发现酵母的MAR可以使转基因的表达水平平均提高12倍，而烟草本身的MAR可以使转基因的表达水平平均提高60倍。来源于鸡溶菌酶基因的MAR也能发挥同样的作用。
另一个可行的方法是采用面向站点的集成技术。这项技术的主要原理是，当转化载体含有与宿主染色体同源的DNA片段时，外源基因可以通过同源重组整合到染色体的特定位点。在实际应用中，首先要分离染色体转录活性区的DNA片段，然后再构建植物表达载体。在微生物的基因操作中，同源重组定点整合已成为常规技术，外源基因的定点整合在动物中已获得成功，但在植物中，除叶绿体表达载体外，鲜有核转化成功的报道。
4.叶绿体表达载体的构建
为了克服外源基因表达效率低、核基因随花粉扩散带来的位置效应和不安全性等问题，近年来出现的一种新的遗传转化技术——叶绿体转化，以其优势和发展前景日益受到人们的认可和重视。到目前为止，已经在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜五种植物中实现了叶绿体转化(侯炳凯等发表)，这使得该转化技术成为植物基因工程中新的增长点。
目前，许多植物叶绿体基因组的全序列已经确定，这为通过同源重组机制将外源基因定点整合到叶绿体基因组中奠定了基础。目前构建的叶绿体表达载体基本上都是定点整合载体。构建的叶绿体表达载体基本属于定点案例载体。构建叶绿体表达载体时，通常在外源基因表达盒的两侧连接一段叶绿体DNA序列，称为同源重组片段或打靶片段。当载体导入叶绿体时，通过这两个片段与叶绿体基因组上相同的片段进行同源重组，就有可能将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。在用于作物改良的叶绿体转化中，要求同源重组后，外源基因的插入不会造成叶绿体基因原有序列的丢失，也不会破坏原有基因在插入点的功能。为满足这一要求，选择了两个相邻的基因作为同源重组片段，如rbcL/accD，16 strnv/rpsl2rps7，psba/trnk，rps7/ndhb。发生同源重组时，外源基因定点插入相邻两个基因的间隔区，保证了原基因的功能不受影响。最近，Daniel等人利用烟草叶绿体基因trnA和trnI作为同源重组片段构建了通用载体。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中高度保守，作者认为该载体可用于许多不同植物的叶绿体转化。如果该载体的通用性得到证实，这项工作无疑将为构建一种方便实用的新型叶绿体表达载体提供一个很好的思路。
由于叶绿体基因组的高拷贝，定点整合到叶绿体基因组中的外源基因往往能高效表达。例如，McBride等人首次将Bt CryIA(c)毒素基因转入烟草叶绿体中，Bt毒素蛋白的表达量高达叶片总蛋白的3% ~ 5%，而通常的核转化技术只能达到0.001% ~ 0.6%。最近Kota等将Bt Cry2Aa2蛋白基因转入烟草叶绿体，也发现烟草叶片中毒性蛋白的表达量很高，占可溶性蛋白的2% ~ 3%，比核转化高20 ~ 30倍。转基因烟草不仅能抵抗敏感的昆虫，还能杀死那些高抗性的昆虫。Staub等人最近报道，转入烟草叶绿体的人生长激素基因表达量高达叶片总蛋白的7%，比核转化高300倍。这些实验充分说明叶绿体表达载体的构建和转化是实现外源基因高效表达的重要途径之一。
定位信号的应用
这些载体优化策略的主要目的是提高外源基因的转录和翻译效率。但是，高水平表达的外源蛋白能否在植物细胞中稳定存在，积累多少，是植物遗传转化需要考虑的另一个重要问题。
近年来研究发现，如果将某些外源基因与适当的定位信号序列连接，使其产生并转运到细胞的特定部位，如叶绿体、内质网、液泡等，可以显著提高外源蛋白的稳定性和积累。这是因为内质网等某些区域为一些外源蛋白提供了相对稳定的内环境，有效阻止了外源蛋白的降解。例如，Wong等人将拟南芥rbcS亚基的转运肽序列与杀虫蛋白基因联系起来，发现杀虫蛋白可以在转基因烟草的叶绿体中特异性积累，外源蛋白的总积累量比对照高10 ~ 20倍。最近，、宋、等。还将rbcS亚基的转运肽序列与PHB合成相关基因相连，试图使基因表达产物在转基因油菜种子的质体中积累，从而增加外源蛋白的含量。此外，万德尔特等人和斯豪滕等人将内质网定位序列(四肽KDEL的编码序列)与外源蛋白基因联系起来，发现转基因植物中外源蛋白含量显著提高。显而易见，定位信号对蛋白质积累有积极的促进作用，但同一定位信号是否适用于所有蛋白质还需进一步确定。
内含子6在增强基因表达中的应用
内含子增强基因表达的作用最早是由Callis等在转基因玉米中发现的，玉米醇脱氢酶基因(Adhl)的第一个内含子(内含子1)显著增强了外源基因的表达，该基因的其他内含子(如内含子8、内含子9)也在一定程度上增强了外源基因的表达。后来Vasil等人还发现玉米果糖合成酶基因的第一内含子可以使CAT的表达水平提高10倍。水稻肌动蛋白基因的第三内含子也能使报告基因的表达水平提高2 ~ 6倍。到目前为止，内含子增强基因表达的机制尚不清楚，但一般认为内含子的存在可能会增强加工效率和mRNA的稳定性。Tanaka等人的许多研究表明，内含子对基因表达的增强作用主要发生在单子叶植物中，而在双子叶植物中则没有。
由于内含子可以增强基因表达，Mcelroy等人在构建单子叶植物表达载体时，特意将水稻肌动蛋白基因的第一个内含子保留在基因启动子的下游。类似地，Christensen等人在构建载体以增强外源基因在单子叶植物中的表达时，将玉米泛素基因的第一个内含子置于启动子的下游。但也有研究指出，特定内含子对基因表达的促进作用取决于启动子强度、细胞类型、靶基因序列等多种因素，有时甚至取决于内含子在载体上的位置。例如，玉米Adhl基因的内含子9位于Gus基因的5’端，在CaMV35S启动子的控制下，Gus基因的表达没有增强。当内含子位于Gus基因的3-末端时，在相同启动子的控制下，Gus基因的表达水平增加了约3倍。可见，内含子对基因表达的作用机制可能非常复杂，如何利用内含子构建高效的植物表达载体还缺乏固定的模式，值得进一步探讨。
7多基因策略
到目前为止，大多数遗传转化研究都是将单个外源基因转入受体植物。但有时由于缺乏单一的基因表达强度或单一的作用机制，无法获得理想的转基因植株。如果将两个或两个以上的协同基因同时转入植物，会比单个基因转化获得更好的结果。这一策略已被应用于培育抗病虫害的转基因植物。例如，根据抗虫基因的抗虫谱和作用机制的不同，可以选择两种功能互补的基因进行载体构建，通过一定的方式将两种抗虫基因同时转入植物中。王伟等人将凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因同时转入棉花，获得了含有二价抗虫基因的转化植株。Barton等人将Bt杀虫蛋白基因和蝎毒素基因同时转入烟草，大大提高了抗虫性和防止害虫产生抗性的能力(专利)。在抗病性方面，我们实验室的蓝海燕等人构建了含有β-1，3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因的双价植物表达载体，并将其导入油菜和棉花。结果表明，转基因植株具有明显的抗病性。最近，冯道荣、李宝健等人将两三个抗真菌基因和hpt基因连接到一个载体上，将两个抗虫基因和bar基因连接到另一个载体上，用基因枪导入水稻植株。结果表明，70%的野生稻后代植株含有全部导入的外源基因(6 ~ 7个)，并且导入的外源基因倾向于整合在基因组的一个或两个位点上。
通常，常规转化不能将大于25kb的外源DNA片段导入植物细胞。而一些功能相关的基因，如植物中的数量性状基因、抗病基因等，大多以“基因簇”的形式存在。如果将一些大于100kb的DNA大片段，如植物染色体中天然存在的基因簇或一系列不相关的外源基因导入植物基因组的同一位点，将有可能出现多个基因控制的优良性状或产生广谱抗虫和抗病，还会赋予受体细胞一条全新的代谢途径，产生新的生物分子。而且大基因组或基因簇的同步插入也可以在一定程度上克服转基因带来的位置效应，减少基因沉默等不良现象的发生。最近，美国的Hamilton和中国的刘耀光开发了新一代载体系统，即BIBAC和TAC，它们克隆了DNA的大片段，并在农杆菌的帮助下直接转化到植物中。这两种载体不仅可以加速基因的图位克隆，而且对于多基因控制下的品种改良具有潜在的应用价值。目前，BIBAC和TAC载体在多基因转化中的应用研究才刚刚开始。
8筛选标记基因的利用和缺失
筛选标记基因是指在遗传转化中，能使转化细胞(或个体)从许多非转化细胞中筛选出来的标记基因。它们通常能使转基因细胞产生对某种选择剂有抗性的产物，使转基因细胞在添加了这种选择剂的培养基上正常生长，而非转基因细胞由于缺乏抗性而对这种选择剂表现出敏感性，不能生长、发育和分化。构建载体时，筛选标记基因连接在目的基因的一侧，每个基因都有自己的基因调控序列(如启动子、终止子等。).目前常用的筛选标记基因主要有两类:抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。前者可对某些抗生素产生耐药性，后者可对除草剂产生耐药性。最常用的抗生素抗性酶基因有NPTII基因(产生新霉素磷酸转移酶，抗性卡那霉素)、HPT基因(产生潮霉素磷酸转移酶，抗性潮霉素)和Gent基因(抗性庆大霉素)。常用的抗除草剂基因有EPSP基因(产生5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘膦)、GOX基因(产生草甘膦氧化酶，降解草甘膦)、bar基因(产生PPT乙酰转移酶，抗双丙氨膦或草铵膦)等。
以上，1，2，3，5，6都是值得注意的，尤其是5，因为你想把它分泌到细胞外。骨架向量可以是PB I121，然后你可以在上面改变基因型。
接下来就是克隆的步骤，相对简单。
1首先获得目的基因的酶切位点，并将其连接到改造后的载体中。
2.将质粒转移到大肠杆菌DH5a中进行扩增。
3.将扩增的质粒转入植物细胞中进行表达。
4.收集根的细胞外培养基检测蛋白的表达和分泌。
至于改造载体的步骤，回答问题的话就简单说说吧。毕竟如果你真的做好了载体，你就可以自己开公司了。