凝血分析仪的检测原理是什么?
凝结(生物物理方法)
凝血法也可称为生物物理法,通过检测一系列物理量(光、电、机械运动等)的变化。)在凝血激活剂的作用下对血浆进行处理,然后通过计算机对得到的数据进行分析,转换成最终结果。
A.当前方法
目前的方法是利用纤维蛋白原不导电而纤维蛋白导电的特性,将待测样品作为回路的一部分,根据凝血过程中回路电流的变化来判断纤维蛋白的形成。然而,由于目前方法的不可靠性和单一,它很快被更灵敏和可扩展的光学方法所淘汰。
B.光学方法(比浊法)
光学血凝仪是根据凝血过程中浊度的变化来测定凝血功能的。
根据待测样品在凝固过程中光线的变化来判断样品的凝固状态。当凝结剂被添加到样本中时,样本的光强度随着样本中纤维蛋白凝块的形成而逐渐增加。仪器将这种光学变化描述为凝固曲线,样品完全凝固后光强不变。通常凝固起点为0%,凝固终点为100%,50%为凝固时间。光探测器接收到这种光的变化,转换成电信号,放大后再传输到监视器进行处理,画出凝固曲线。
光学凝血试验的优点是灵敏度高,仪器结构简单,易于自动化。缺点是样品的光学异常,测试杯的光滑度,样品中的气泡都会成为测量中的干扰因素。
C.磁珠法
早期的磁珠法是在检测杯中放一个磁珠,用杯外的铁磁性金属棒把它贴成一条直线。标本凝固后,由于纤维蛋白的形成,磁珠从金属棒上移位离开,仪器据此检测凝固终点。这种仪器也可以称为平面磁珠法。早期的平面磁珠法可以有效克服光学法中样品背景干扰的问题,但存在灵敏度低的缺点。
现代磁珠法出现于80年代末,90年代初进入商业化,现代磁珠法称为双磁珠法。双磁路磁珠法的测试原理是:在测试杯的两侧有一组驱动线圈,产生恒定的交变电磁场,使测试杯中特制的消磁钢球保持等幅振荡。加入凝血激活剂后,随着纤维蛋白生成量的增加,血浆粘度增加,小钢球运动幅度逐渐减弱。仪器根据另一组测量线圈感应到的小钢球运动的变化,确定运动幅度衰减到50%时的凝固终点。
底物显色法(生化法)
底物显色法是通过测定显色底物的吸光度变化来估计被测物质的含量和活性,也可称为生化法。检测通道使用卤素灯作为检测光源,波长一般为405nm。探测器与光源在一条直线上,类似于色度计。
血凝仪利用显色底物检测血栓和止血指数的原理是人工合成一种与天然凝血因子氨基酸序列相似、具有特定作用位点的小肽,将可水解的显色化学基因与作用位点的氨基酸连接起来。由于凝血因子具有蛋白水解活性,它不仅可以作用于天然蛋白肽链,也可以作用于合成肽链底物,从而释放出呈色基因,使溶液呈色。产生颜色的深浅与凝血因子的活性成正比,所以可以准确量化。目前人工合成的多肽底物有几十种,最常用的是对硝基苯胺(PNA),呈黄色,波长405mm即可测定。
免疫学方法
在免疫学方法中,将纯化的物质作为抗原制备相应的抗体,然后通过抗原抗体反应对该物质进行定性和定量测定。常用的方法有:
A.免疫扩散法。将被测物质与相应的抗体在一定的介质中结合,测量其沉淀环的大小,与标准比较,计算出被测物质的浓度。该方法操作简单,不需要特殊设备,但耗时太长,灵敏度低,仅适用于含量较高的凝血因子的检测。
B.箭头电泳。在一定电场下,凝胶支持物中的被测物质与其对应的抗体结合形成“火箭峰”,火箭峰的高度与其含量成正比。测量峰高,并与定量测定的标准进行比较。这种方法操作复杂,临床应用较少。
C.二维免疫电泳。一些分子结构异常的凝血因子可以通过水平和垂直方向的电泳分离。
D.酶联免疫吸附试验(ELISA)。用酶标抗原或抗体与被检测物进行抗原结合反应,通过洗涤除去样品中未结合的抗原或抗体和干扰物质,留下固定在管壁上的抗原抗体复合物,然后加入酶的底物和显色物质反应生成有色物质,用酶标仪测定,颜色深浅与被检测物的浓度成正比。该方法具有高灵敏度和特异性,并已用于检测许多止血和血栓形成成分。
E.免疫比浊法。将测试对象与其相应的抗体混合形成复合物,从而产生足够大的沉淀颗粒,该颗粒通过透射浊度或散射浊度来确定。该方法简单、准确,便于自动化。