细胞培养原理|细胞冷冻保存技术
2.在大多数细胞系中，细胞会随着衰老和进化而发生变化，产生表型和基因型的“培养漂变”。在冻存过程中，恰当的操作和适宜的冻存条件可以减少细胞特性的改变或丧失，起到细胞保存的作用。因此，正确成功的冷冻保存对细胞的长期应用起着非常重要的作用。
1.当温度低至-70℃时，细胞内的酶活性和代谢活动全部停止，从而实现长期保存的目的。
2.随着温度的降低，细胞内外的水分会结晶，形成的冰晶会破坏细胞膜和细胞器，从而引起细胞死亡，特别是在0~-20℃阶段，冰晶呈针状，造成细胞损伤。细胞在没有任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内的水分与外界环境会形成冰晶，导致机械损伤、电解质增加、渗透压变化、脱水、pH值变化、蛋白质变性等，并可导致细胞死亡。
3.常用的防冻剂是甘油或二甲基亚砜(DMSO)。DMSO能迅速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻结过程，增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。
1.DMSO一般用作细胞冷冻保存中的保护剂。在细胞冻存中，DMSO的最终浓度一般为5-15%，具体的细胞冻存液中DMSO的浓度可以从ATCC找到。
2.对于特别敏感的细胞，需要在冻存过程中测试适用的冻存液。比如神经元冷冻时，应选择无血清冻存液，避免复苏后分化。
？有限细胞系的形态和代谢活性的维持
？珍贵细胞保存
？细胞株标准品的制备
？脐带血干细胞和NK细胞的冷冻保存
1.用于冷冻保存的细胞一般选择在对数生长期，此时汇合度约为90%。此时细胞生长良好，细胞数量多，收获细胞前24小时更换培养基。
2.检测培养物中的微生物污染物，尤其是支原体，以确保细胞不受任何污染。在细胞采集的过程中，实验操作要尽量温和，避免细胞损伤。
1.细胞冷冻速率的最优控制是让细胞有足够的时间脱水，而不被过度脱水所损伤。对大多数细胞来说，每分钟下降65438±0至3℃是合适的。
2.梯度降温法:4℃-30 min，20℃- 2h，-80℃冰箱过夜，第二天将冻存管转移到液氮罐中长期保存。
3.细胞程序冷却箱:将准备好的细胞冻存管放入冷冻箱中，在-80℃过夜后直接转移到液氮槽中。
4.？必须在转移存储位置的过程中快速完成。建议在转移过程中将冻存管放在干冰中恒温保存，避免转移过程中温度变化对细胞活力的影响。
1.细胞也可以在-80℃的冰箱中保存几个月。
2.细胞的长期保存温度为-130℃或更低。
3.液氮罐内气体层的温度在-140℃到-180℃之间，细胞可以保存在气体层中，也可以浸在液氮中，如果可能的话最好保存在气体层中，因为这样可以避免细胞取出时因为液氮进入冻结管而发生爆炸(但液氮罐内只能保存少量液氮，需要经常添加)。
HyCyte？冷冻保存液是一种即用型、无血清、无需程序降温的“长期”细胞冷冻保存液。本品配方使用15年以上，原料日本进口，冷冻保存质量与日本产品一致。
？安全:无血清，无外来动物成分。
？广谱:适用于多种细胞类型。
？高效:复苏后细胞保持高活性并快速增殖？能力，不影响细胞功能
？方便:即用型，无需额外准备，无需程控冷却箱和稀释。
细胞膜保护剂——能在细胞膜外瞬间形成一层保护膜，保护细胞免受胞外冰晶的伤害。
渗透保护剂——能快速渗透到细胞内部，防止细胞内部产生大量冰晶，同时保护细胞器，减少低温下对细胞器的伤害。
细胞沉降稳定剂——能平衡细胞的沉降速度，防止细胞在冷冻保存过程中聚集在一起。