蛋白质光谱的原理和应用(二)

质谱仪性能参数

作为质谱仪的使用者，如何评价一台质谱仪的性能？或者说，我们如何选择质谱仪？质谱仪的主要性能参数如下所示。我来依次解释一下这些高大的参数名是什么意思。

检测能力

“官方”的定义是相当于三倍噪音的物质的量，我们可以理解为质谱仪能检测到的最低化合物的浓度或量。对于低于这个值的化合物，这个质谱仪就无能为力了。

我如何知道我的质谱仪的检测极限？通常我们会用利血平作为标准化合物来确定质谱仪的检出限。比如我们在质谱仪中注入50 fg (Fick)利血平，如果我们得到的信噪比能达到100-1000，那么我们就可以认为这台质谱仪的检出限是好的。50 fg利血平只含有几万个利血平分子，也就是说，如果含有几万个小分子的化合物都能检测出来，那么这个质谱仪的灵敏度就相当高了。你可以认为灵敏度和检测限评价的是同样的性能。

线性范围

这个性能参数也很重要。表示在什么浓度范围内，质谱仪检测到的信号与样品浓度之间存在线性关系。简单来说，用这个质谱仪检测这个浓度范围内的样品比较合适。高于或低于该浓度范围的样品需要被浓缩或稀释，然后才能被该质谱仪检测到。

通常质谱仪的线性范围是3-6个数量级，即1，000–1，000，000。大多数质谱仪的范围是1，000–10，000。

这个参数很重要，因为当我们分析的样品的含量范围很广时，比如有的样品只有几十微克/毫升，而有的可以达到几毫克/毫升。在这个较宽的浓度范围内，如果质谱仪的线性范围很好，我们可以直接进样，不需要对低浓度样品进行浓缩，也不需要对高浓度样品进行稀释，这样可以大大降低样品预处理的复杂程度，节省时间，节省实验步骤。

分辨率和质量准确度

这是两个非常重要的参数。我们常说的高分辨率质谱，是指极高的分辨率和高质量的准确度。如何理解这两个参数？我们先来看看下面这张图:

分解率

质谱仪可以区分的是最后两个质谱峰之间的质量差。

这是什么意思？假设我有两个强度相同的质谱峰。当两个山峰非常接近的时候，在什么情况下我才能清楚的判断出是两个山峰，而不是一个？基本规律是，当这两个峰重叠部分的高度不超过任一质谱峰峰高的10%时，我们认为这两个峰是可分的。另一方面，如果两个峰的重叠部分超过10%，则认为是不可分的，即不能按照两个峰来处理质谱。

当两个峰的基线分离度为10%时，我们来测量任意质谱峰的半峰宽(即峰高处的半峰宽)，然后用任意峰的质荷比除以半峰宽得到分辨率。目前高分辨率质谱仪的分辨率可以达到50000-100000的量级，一般的四级杆可以达到5000-10000。

那么，高分辨率质谱的优势是如何体现的呢？以上面右图为例。当我们用低分辨率质谱仪检测一种物质时，只能得到最外面的蓝色质谱峰。当我们不断提高分辨率的时候，会逐渐发现这个质谱峰其实包含了几个小的质谱峰，高分辨率质谱仪得到的质荷比和低分辨率质谱仪得到的质荷比有非常明显的不同。这对于化合物鉴定是非常重要的信息。如果我们计算错了质荷比，我们将很难识别正确的蛋白质。

下图也可以直观的告诉我们质谱高分辨率检测的优势。

比如我们扫描一个分辨率为17500的化合物，会发现在质荷比280.09的位置有一个非常胖的质谱峰(第一个谱图中用红圈标出)。我们可能认为这是一个化合物，所以我们会开始识别这个化合物。但是，当我们不断提高质谱仪的分辨率到一定程度时，会发现这其实是两个不同的峰(第四个谱图中用红圈标出)。

也就是说，利用低分辨率质谱中获得的质荷比来鉴定化合物，获得的信息其实是不完整的(不一定是错误的)，而通过高分辨率质谱，我们可以获得关于化合物更全面的信息，帮助我们做出正确的判断。

质量准确性

指质谱仪测得的质荷比与其实际质荷比之差，除以其实际质荷比与1，000，000的乘积。所以是以ppm(百万分之一)为单位，这样看起来更方便。目前高分辨率质谱仪的质量精度在2-5 ppm范围内。

那么，我们如何衡量质谱仪的实际分辨率和质量精度呢？以秦丽老师的一个实验数据为例:

比如我们选取质荷比为511.6的峰，计算出其半峰宽为0.012，那么其分辨率为511.6除以0.012，数值为42500，而软件给出的分辨率为48。

同样的例子，让我们来计算质量精度。测得的质荷比是511.5978，而这个峰的实际质荷比是511.5995，所以计算的质量偏差是3.3ppm，也就是说这个实验的误差是3.3ppm，这样的质量偏差范围通常是可以接受的。

分离度的重要性可能很容易理解，那么质量准确度会如何影响化合物的鉴定呢？我们以利血平为例。

利血平分子在质谱中将在609.066处有一个质谱峰。当我们用单个四级杆分析利血平时，单个四级杆的质量准确度约为0.1质量单位(165ppm)。也就是说，当利血平注射到一个四极质谱中，四极质谱会告诉我们，这个化合物的质荷比大概在609.2-609.4的范围内。

那么问题来了！在609.2-609.4范围内，我们能与C、H、O、N四种元素结合成多少种化合物？答案是:209种！也就是说，我们要判断这个化合物是不是利血平，得到正确结果的可能性只有1/209！

随着我们不断提高质量准确度，可以组合的可能化合物会越来越少。当质量精度达到3 ppm时，只有四种可能的化合物。当它达到2 ppm时，只剩下两种可能的化合物。这个时候我们会判断化合物是不是利血平，这样准确率会高很多。这就是为什么高分辨率质谱仪对于化合物的鉴定非常重要，可以大大减少候选化合物的数量，提高鉴定的成功率。

可以说分辨率和质量偏差分别评价了质谱仪的精密度和准确度。就像射击，比如我每次都能打中右上角的一点，说明射击的精度很高，但如果我的目标是靶心，说明精度差。另一种情况，比如我多次击中目标，击中的点比较分散，东边一发，西边一发，但平均位置正好在靶心上。可以认为质量精度还可以，但是精度比较差。所以我们希望的是质谱仪的精度和准确度非常高。

目前我们可以使用的高分辨率质谱仪，无论是QTOF还是Orbitrap系列，都可以达到50000以上的分辨率和2-3ppm的质量精度。所以做蛋白质组学研究的童鞋们比以前开心多了！

我给大家分享了几个评估质谱仪的重要参数。然后我们会对不同质谱的表现做一个大概的总结。

1、四极和离子阱:它们的质量扫描范围有限，通常在10-4000。4000以上，四极杆和离子阱只能用于离子传输，不能用于离子检测。它们的分辨率一般是2000-4000，好一点的离子阱可以达到10000-20000。扫描速度不是很快。它们的优点是价格很低，整个仪器可以做得很小。

2.TOF:它最大的优点是可测质量范围理论上可以无限大，也可以无限小。如果要检测的离子没有质量，其飞行时间将为零，因此可以检测到质荷比为零的离子。同样，如果一个离子的质量是无限的，那么它的飞行时间也是无限的，理论上是可以检测的。TOF的分辨率是5000-60000，扫描速度很快。它的缺点是TOF需要很长的离子跑道，所以仪器的体积会很大。

3.FTICR:优点是分辨率很高，可以达到1，000，000甚至更高。缺点是扫描速度比较慢，需要一个超导磁体，运行起来非常昂贵，而且FTICR质谱仪本身的价格也很高，通常在1万美元以上。

4.轨道阱:克服了FTICR必须使用超导磁体的缺点。它的分辨率可以达到65，438+000，000到65，438+0，000，000，而且扫描速度不是很快，价格比FTICR低。受专利保护，目前只有赛默飞公司能生产。

对于蛋白质组学研究，我们对质谱仪性能的最低要求是:分辨率至少要达到40000-50000，质量精度要优于5ppm，质量扫描范围要达到100-3000，扫描速度至少要达到每秒一个高分辨率一级谱图和十个高分辨率二级谱图。满足以上条件，就满足了蛋白质的组织学最基本的要求。

串联质谱

上面提到了各种质谱仪的优缺点，所以这里引入串联质谱的概念:将相同或不同的质谱仪串联起来，实现串联或并联运行。这样做有两个目的:产生二次碎片离子(为什么会产生二次碎片离子？后面会讲到)以及实现不同质谱仪的优势互补。

我们知道不同质谱仪的性能是不同的。比如四极质谱可以实现离子选择，但是分辨率比较差，而TOF不能实现离子选择，但是分辨率比较高。那么我们能不能把不同性能的质谱仪串起来，让它们一起工作呢？我们通常使用串联质谱或MS-MS来达到这个要求。有许多方法可以将它们结合起来:

第一种:三重四极，或串联四极，是将三个四极串联起来。这样做的主要目的是实现二次质谱的扫描。

第二种:四极杆与飞行时间质谱仪串联，也就是我们经常听到的。实际上是为了提高二级质谱仪的分辨率。

第三种:轨道阱和四极的组合，比如轨道阱聚变，或者轨道阱和离子阱的组合，比如轨道阱精英，就是这样的组合。

先说如何用串联质谱仪获得二次碎片离子。

以上是串联四级杆结构示意图。串联四级杆，或三联四级杆，由三个四级杆串联而成。通常把第二个四级杆换成六级杆或八级杆，但我们还是叫四级杆。这个四极并不是一个质量选择系统，而是一个碰撞池，也就是碰撞池，用来碎片化离子。

当串联的四极杆工作时，第一个四极杆打开质量选择模式，允许具有特定质荷比的离子通过质谱仪，同时将所有其他离子抛出(到四极杆上或进入四极杆的空间)。然后，当一个特定的离子被选中时(称为母离子)，它将进入碰撞单元。

碰撞池中有这样一种结构，入口和出口之间存在电压差。通常，入口电压会高于出口电压。当母离子进来时，它们会被电压差加速。此外，碰撞池将充满氦气或氮气。当离子被加速时，会与碰撞池中的氦或氮分子发生碰撞和断裂，形成一些碎片，这些碎片称为碎片，即碎片离子或子离子。这些碎片离子会进入第三个四极杆，进行二次扫描，得到二次质谱。

下图是串联的四极质谱计。我们可以看到它仍然是一个非常紧凑的结构。

三四级酒吧

我们以莱克多巴胺为例，看看它的分子通过串联质谱仪会发生什么变化，会得到什么样的谱图。

莱克多巴胺是一种兽药。其分子量为301.1672，结构式如上图所示。第一张图，测得的质荷比是302.1744，是一级质谱的扫描，在302.1744有一个莱克多巴胺的质谱峰。

然后，我们告诉质谱仪在302.1744挑出离子，并将CID(碰撞诱导解离)电压设置为10V，即在碰撞池的入口和出口加一个10V的电压差，使离子以10V的碰撞能量进行碰撞。碰撞后，在第二张图中，我们可以看到302处的信号强度变弱，而284和164处的信号强度变强，之前没有看到的107、121和136处的信号也出现了。

接下来，我们将碰撞电压从10V增加到25V。增加后我们会发现302处的信号完全消失，说明原来在第一个四极选择的离子经过高能碰撞后完全断裂，断裂成91，107，1265438。那么这些碎片离子是什么呢？

通过结构分析，我们会发现它们对应着莱克多巴胺的不同片段结构，比如164实际上对应着莱克多巴胺的右半部分，136对应着左半部分，等等。

通过分析片段的化学结构，我们可以将它们放在一起，形成一个完整的莱克多巴胺分子。这就是我们如何通过二级质谱鉴定化合物的结构。实际的鉴定过程往往更加复杂和伤脑筋。以上只是一个简单的例子。

然后，对于多肽，或者蛋白水解后的多肽片段，我们可以通过相同的过程来鉴定多肽序列，通过分析理论上可以从多肽中获得哪些片段，然后将它们与谱图进行比较。这部分后面会详细讨论。我们先来看一个简单的例子，如下图:

例如，如果我们在左上角有一个肽段，我们理论上可以得到各种用灰色标记的b-y离子。通过质谱分析，可以找到对应的碎片离子(右图表格中红色标注的碎片离子都在质谱中找到)。通过汇集这些信息，我们可以知道多肽的序列是什么。

以三重四极杆为例，和大家分享了串联质谱仪是如何获得二级碎片离子和二级谱图的。然后，其他一些系列质谱仪也差不多。

Q-TOF

Q-TOF实际上与串联四极杆非常相似，只是它用飞行时间质谱仪代替了第三个四极杆。也就是说一个四极，一个碰撞池，然后是一个飞行时间质谱仪。为了增加飞行距离，我们会让离子转个弯飞回来。这被称为反射模式飞行，它允许离子在更短的空间内飞得更远。

下图是布鲁克生产的Q-TOF质谱仪。它的飞行筒管长度可达3.6米，离子往返7.2米。大家可以关注一下这个数字，后面讲到真空度的时候我们会再提到。

轨道陷阱系列

Orbitrap系列比普通串联质谱仪复杂，你可以通过下面的示意图感受一下。

这个系列有几个系列的质谱仪，比如Q Exactive质谱仪，它的Q1也是四极，Q2是碰撞池，Q3被轨道阱代替。

再比如Orbitrap Elite，它的Q1是离子阱，Q2是碰撞池，Q3是Orbitrap。也就是说，Orbitrap Elite没有四级极点，它用一个离子阱代替了四级极点。

还有一个是Orbitrap Fusion(见下图)，是三个质谱仪的组合。它的第一级是四极，第二级是离子阱，第三级是轨道阱。同时它还有一个碰撞单元，整体上是一个非常复杂的结构。其特点是轨道阱和离子阱可以同步扫描。

在一般的质谱仪中，不能同时扫描两个质量检测量，只能一个用于质量检测，一个用于过滤。Orbitrap聚变和Orbitrap中的离子阱可以同时扫描，也就是说它是并联结构，而不仅仅是串联，所以它的扫描速度会更快，性能会更好。融合的分辨率可以达到24万–96万。

上面分享了几个常见的质谱仪，下面我们就以Q-TOF为例，学习一下质谱仪的基本结构。

对于质谱仪来说，最核心的部分就是质量分析器，它包括两个部分，也就是我们前面详细介绍的质量过滤器和质量检测器。质谱仪的所有其他部分都服务于这个核心部分。

除了这个核心部件，质谱仪还需要以下辅助部件:

质谱辅助系统

真空系统:为什么需要真空系统？我们知道，质谱仪是检测气态离子质荷比的仪器。气态离子在空气中飞行时，会与空气分子发生碰撞，其电荷可能被撞出，变成不带电荷的气态分子，质谱仪就无法再测量其质荷比。所以我们希望这种气态离子能够在质谱仪中稳定存在，所以质谱仪需要真空系统，这样离子才能稳定飞行，不受其他空气分子的干扰。

真空系统通常需要两级。第一阶段是低真空，由机械泵或油泵提供。可以是1-3毫巴左右，是大气压的千分之一。低真空的目的是为高真空提供备用压力环境。高真空由涡轮泵提供，其真空度为-1e-5 ~-1e-10 mbar。在这样的真空环境下，空气分子基本都被抽干净了。

也许你要问，为什么要求这个数量级的真空条件？

我们先介绍一个概念，叫做离子平均自由程，意思是一个离子在真空环境中飞行多长时间就会遇到下一个空气分子。这决定了离子在真空中可以稳定存在多久。

以串联的四极子为例。串联的质谱仪长约1米，所以我们希望离子在1米的飞行过程中不要碰到其他空气分子。所以对于串联的四级杆，只要能保持真空度保证1米的距离内不会碰到空气分子。所以串联一个四级杆通常只需要-1E5 mbar的真空。

对于Q-TOF，离子的飞行距离大概是5-7米(大家还记得吗？前面介绍Q-TOF的时候特别提到了7米的飞行距离)，比串联一个四极的飞行距离长了近一个数据级。所以Q-TOF质谱仪要求的真空度大约是-1E-6 ~ -1E-7毫巴，以保证离子在这么长的飞行过程中不会与其他空气分子发生碰撞。

对于Orbitrap质谱仪来说，离子在里面飞行的时间可以达到1秒，而且会飞很远的距离，所以Orbitrap需要的真空度是-1E-10 mbar。

离子源系统:我们需要将样品从大气压下的非电离环境引入质谱仪，使其变成气态离子，所以我们需要一个离子源来实现这个功能。

计算机系统:实现质谱仪的控制和数据采集。

气体系统:气体供应和废气处理(氮气和氩气)

电源:UPS不间断电源系统。

加上核心部件质量分析仪，以上就是组成质谱仪的六个系统。后面我们还会讨论各部分的结构、使用和维护。

安装了这六个部件的质谱仪可以用下面的示意图来表示。通常情况下，质量分析器和高真空涡轮泵会装在一个大盒子里。这个模块叫主机，低真空泵(油泵)会放在主机外面，因为这个部分会产生很多振动、噪音和热量，所以需要单独放置，防止振动对质谱仪的影响。质谱仪前面会有一个离子源，侧面会有一个废气出口。质谱仪和泵产生的废气会通过这个排气管排到外面。特别是泵产生的废气通常具有致癌性，所以排气尤为重要。

日记