请教大家关于狂犬病抗体检测RFFIT的知识
1996年2月，应蒋安立博士邀请，我室研究员严家新赴法国巴斯德研究所研究狂犬病毒抗原抗体检测技术，带回了蒋安立博士捐赠的许多资料和实验材料。
1996年3月，蒋安立博士再次专程来我院。之后的十几年，蒋安理博士每年都来中国访问；他的继任者布尔希博士也多次来华，与我院开展狂犬病病毒分子流行病学及相关诊断试剂研究，协助我院建立符合世卫组织标准的狂犬病检测中心，培养博士生，并与欧洲等机构申请研究项目经费。
本文的研究结果再次证明，RFFIT的重复性、特异性和敏感性并不低于MNT(小鼠中和试验)，而且更快、更便宜、更简单，在大多数需要RV中和抗体的情况下可以替代MNT。
1998 10由蒋安立博士和Bourhy博士发起并组织的由PRA(中法高级研究计划)支持的中法狂犬病诊断与控制培训班在中国疾控中心传染病研究所(京)成功举办(唐庆主办)。我院的严家新、徐格林参加了此次培训。
本实验室的产品已四次送法国巴斯德研究所世卫组织狂犬病参考与合作中心试用，结果的特异性和敏感性均优于国外同类产品。在我国几次全国性的狂犬病研讨会和讲习班上，我们建立的方法和配制的试剂得到了好评，并与国外试剂进行了大量的现场对比试验，证明效果相同或更好，而成本却大大降低。多年来，法国巴斯德研究所不仅购买了大量我们生产的检测试剂盒，还购买了我们的单克隆抗体(原料)用于相关研究。
本实验室制备的狂犬病病毒检测试剂已出口到法国、突尼斯、希腊、伊朗等国家，用于狂犬病的实验室诊断。根据用户反馈，我们产品的检测灵敏度优于国外同类试剂。
(此项工作由法国巴斯德研究所世卫组织狂犬病参考与合作中心主任HerryTsiang博士进行技术指导，并由法国巴斯德Merieult血清疫苗公司(PMSV)提供部分资助。)
在国内首次制备抗狂犬病病毒(RV)核蛋白(NP)荧光标记抗体的基础上，建立了快速荧光焦点抑制试验(RFFIT)检测RV中和抗体。与小鼠中和试验(MNT)相比，重复性、特异性和敏感性无显著差异。在大多数需要检测RV中和抗体的情况下，该方法可以替代MNT。
狂犬病在中国和许多发展中国家仍然是一个严重的问题[1-3]，因此迫切需要建立和推广与狂犬病病毒(RV)相关的各种快速实用的检测方法。世卫组织专家委员会肯定并推荐小鼠中和试验(MNT)和RFFIT作为检测RV中和抗体的两种基本方法[4]，并建议尽可能用RFFIT替代MNT，因为前者更快、更便宜、灵敏度与MNT相当。RFFIT需要抗RV核蛋白(NP)的荧光抗体。在国内成功试制该关键试剂[5]的基础上，我们建立了micro-RFFIT方法，并将该方法的重复性、特异性和敏感性与MNT进行了比较。该方法有望广泛应用于狂犬病的临床诊断、疫苗质量控制和流行病学调查。相关实验结果报告如下。
BHK21/BSR细胞、适应于该细胞系的RV攻击病毒CVS株(ATCCVR959)、已知中和效价(IU/ml)的抗RV标准血清(批号I-1995-10-11)由法国巴斯德公司生产。接种RV疫苗前后的人血清(法国巴斯德Merieult血清疫苗公司生产的VERORAB或我所生产的RV疫苗)由我室肖定昌博士提供。
细胞培养基:D-MEM，GibcoBRL产品。Lab-Tak细胞培养载玻片，Nunc产品。Falcon96孔平底细胞培养板。Opton荧光显微镜。抗RVNP荧光标记抗体的参考标准为法国巴斯德赛诺菲诊断产品公司产品(批号6E022U)，简称pNF在本文中。本实验室制造的相应产品，本文简称mNF，参考文献[5]；在本文中未注明pNF的地方，使用mNF。
组织培养中RV的快速滴定根据文献[5-6]，待测RV样品经系列稀释后感染BSR细胞，24小时(固定病毒)或48小时(街头病毒)可检测到细胞质中包涵体(主要由RV组成的NP)的荧光。通常在低倍显微镜(160X)下检查20个视野(使用Lab-Tak载玻片时)或8个视野(使用96孔细胞培养板时)。滴度用reed & amp；用明希法计算，用荧光焦点单位(FFU/毫升)表示。在RFFIT过程中使用CVS菌株攻击病毒，病毒的最佳攻击剂量为孵育24小时后可感染80%细胞(产生荧光包涵体)的最高稀释度。
将固定量的CVS病毒与一系列稀释的待测血清(包括已知效价的参考血清)孵育(体外中和反应)，然后加入敏感细胞(BSR)悬液。孵育24小时后，用丙酮固定细胞单层，并用荧光抗NP抗体染色，以检测未中和病毒的存在(荧光焦点)。与病毒对照组相比，将每份待测血清的FFU/ml固定量CVS病毒的稀释度降低50%，然后与已知效价的参考血清比较，计算每份待测血清的中和抗体效价。
将同一株CVS病毒分装，70℃保存，半年内用mNF和pNF测定其效价6次。结果相当稳定，它们之间没有差异(对于病毒稀释度1103.5，t=0.445，P0.05；对于病毒稀释度1104.2，
T=0.353，P0.05，见表1)。该CVS株在小鼠体内的毒力效价测定为5.5 logd 50/ml(Sm = 0.4 logd 50/ml)，可作为毒力参考标准，换算未知样品在小鼠体内的毒力效价(小鼠LD50效价可根据未知RV样品的效价与组织培养中该参考样品的效价之比直接换算，以FFU/ml表示)。CVS毒力参照经24小时孵育可感染80% BSR细胞，最高稀释度为1160，作为RFFIT的最佳病毒攻击剂量。
以法国巴斯德研究所提供的抗RV标准血清为参照，用RFFIT和MNT分别测定参照血清A和B的中和效价4次，结果见表2。两种方法无显著性差异(对于样本A，t=0儿童棉鞋。444，P0.05对于样本b，t=0。768，P0.05)，可以认为两种方法得出的结果基本一致。
用RFFIT (mNF和pNF平行使用)和MNT(只看样品中和效价是否大于0.5IU/ml)测定52份人血清样品接种RV疫苗前后的RV中和效价。在RFFIT的测定中，mNF和pNF获得的荧光抗体滴度的符合率(52/52)为100%，而RFFIT和MNT的符合率(51/52)为98%以上。一个不匹配的样本被确定为阴性，通过RFFIT重新测试，滴度略高于临界值(0.5 IU)。这也说明RFFIT的灵敏度可能略高于MNT。
同时检测了接种VERORAB疫苗(37号和45号)和接种我所生产的RV疫苗(121号)的人在不同时间采集的18份血清标本的RV中和抗体滴度。结果表明，RFFIT和MNT测定同一份血清的效价基本一致。与相应的算术平均值相比，大多数结果是相同的。
本实验室制备的mNF成本低，效果稳定。在上述应用试验中，特异性和敏感性与法国巴斯德赛诺菲诊断产品公司相应产品pNF完全相同。这两种试剂在法国巴斯德研究所世卫组织狂犬病参考与合作中心的对比试验也获得了相同的结果(H.Tsiang，personal communication)。
基于应用抗NP荧光标记抗体的RFFIT方法的原理和结果与MNT高度一致(都是特异性检测抗RV的保护性中和抗体)，且比MNT更快(实验时间从14天减少到2个工作日)，更便宜，可重复性更好，因此得到了世卫组织的肯定和推荐[4]，成为国际上接受最广泛的MNT。
Fitzgerald等人[8]在三个实验室进行了合作研究，以比较MNT和RFFIT的可重复性。同一样品在同一实验室检测时，MNT的变异范围为67%-149%，RFFIT的变异范围为68%-146%。本文用RFFIT和MNT分别测定了参考血清A和B的中和效价四次。MNT对样品A和B所得结果的变异范围分别为81%-123%和78%-129%，RFFIT对样品A和B所得结果的变异范围分别为83%-120。结果表明，RFFIT的重复性不低于MNT，两种方法检测结果无显著差异。
Zalan等人[9]将RFFIT方法小型化，即用96孔细胞培养板代替昂贵的Lab-Tak细胞培养载玻片。其优点是可同时处理大量样品，大大减少了试剂用量，观察结果容易，减少判断误差。本文的研究结果也证明了这种小型化方法更有优势，值得推广。
综上所述，本文结果再次证明RFFIT的重复性、特异性和敏感性不低于MNT，且具有更快、更便宜、更简单的优点。在大多数需要检测RV中和抗体的情况下，RFFIT可以替代MNT，有望在我国狂犬病的预防和研究中得到广泛应用。
5.严家新，李成平，徐格林，等。抗狂犬病毒核蛋白荧光标记抗体的制备及初步应用，第四届全国生物制品会议论文集，武汉，1997，P110。
8.菲茨杰拉德，卡巴索夫，史密斯等人。通过血液中和试验(MNT)和超高效荧光聚焦抑制试验(RFFIT)进行的关于试验动物免疫球蛋白(人)的实验室研究。生物站，1979，7(1):67。
基于荧光素标记的抗体可储存病毒(RV)核蛋白(NP)的制备，建立了用于定量研究中和抗体的荧光聚焦抑制试验(RFFIT ),并将其重复性、特异性和敏感性与中和试验(MNT)进行了比较。
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